Le dosage quantitatif des cellules T reflète la charge infectieuse de Mycobacterium tuberculosis dans un modèle de contact de cas endémique

Contexte Actuellement, des marqueurs d’efficacité fiables pour l’évaluation des nouvelles interventions contre la tuberculose tuberculeuse sont limités à la maladie et à la mort. Une mesure plus précise de la réponse immunitaire humaine à une infection à Mycobacterium tuberculosis peut être importante Un test ELISPOT qualitatif enzymatique lié à une cible antigénique précoce Nous avons évalué les réponses quantitatives au test cutané ELISPOT et PPD à l’exposition récente à la tuberculose. Méthode Nous avons étudié le test cutané PPD quantitatif et le test ELISPOT PPD. résultats en contacts familiaux sains de patients index avec des cas de tuberculose à bacilloscopie positive et culture positive en Gambie, selon une réponse ELISPOT ex vivo positive ou négative à des antigènes spécifiques à la tuberculose ESAT- / CFP- Nous avons ensuite étudié le test cutané quantitatif PPD et PPD EL L’ISPOT permet d’obtenir des résultats positifs chez les patients ayant des résultats positifs ESAT- / CFP contre un gradient d’exposition naturel en fonction de la proximité du patient TBResults. Le nombre de résultats positifs était significativement plus élevé pour les tests cutanés PPD et ELISPOT PPD en ESAT- / CFP- Sujets positifs, comparés aux autres P & lt; Cependant, lorsque les résultats du test cutané PPD quantitatif et du test ELISPOT PPD ont été comparés chez des sujets positifs ESAT / CFP, seul le compte ELISPOT était sensible au gradient d’exposition, augmentant significativement en fonction de l’exposition P = Conclusions La réponse ELISPOT quantitative au PPD -Antigène-contacts positifs des patients atteints de tuberculose reflète la charge infectieuse de M tuberculose à la suite d’une exposition récente Cette découverte offre de nouvelles possibilités pour l’évaluation de l’efficacité de nouvelles interventions, et ajustement doit être fait pour elle en reliant la réponse immunitaire précoce à progression vers la maladie

Un obstacle important à l’évaluation des vaccins et autres interventions contre les agents pathogènes qui subissent une période de latence est le délai prolongé – souvent des décennies – avant le début de la progression vers la maladie. Une alternative est d’utiliser un biomarqueur reflétant le statut infectieux de Mycobacterium tuberculosis d’infection dépendait du test cutané conventionnel PPD, qui a une sensibilité et une spécificité inconnues et est sujet à variation selon l’âge, le sexe et la latitude Il est également sujet à l’inhibition par les mycobactéries ingérées , ce qui peut expliquer Ces propriétés rendent le test cutané PPD problématique pour l’établissement des critères d’entrée et des points finaux d’infection pour les études de nouvelles interventions. Il a été démontré qu’une réponse ex vivo des lymphocytes T positive était présente dans la tuberculose. aux antigènes «early-sécrétés» de M tuberculosis cible antigénique sécrétoire précoce [ESAT-] et filtrat de culture protéine [CFP-] par dosage immuno-enzymatique ELISPOT identifie les individus susceptibles d’être récemment infectés par M tuberculosis à la suite d’une exposition récente Récemment, nous avons signalé que l’utilisation de ESAT- et CFP- par ELISPOT fournit une spécificité améliorée sur PPD par ELISPOT et test cutané dans le diagnostic de l’infection à M tuberculosis en Gambie un cadre tropical où la tuberculose est endémique par l’analyse des résultats qualitatifs, oui ou non Parce que le test ELISPOT et le test cutané PPD sont des mesures quantitatives immunité médiée, l’ampleur de la réponse peut fournir des informations importantes concernant la relation entre l’infection par M tuberculosis et l’hôte, comme la probabilité de transition vers la latence par rapport à la progression vers la maladie Par conséquent, dans la présente étude, cohorte de contacts familiaux sains de patients atteints de tuberculose en Gambie et évaluation des réponses quantitatives au test cutané ELISPOT et PPD de M tuberculosis ding à M exposition à la tuberculose

Méthodes

Les participants Indexent les patients avec des cas de tuberculose à bacilloscopie positive qui étaient & gt; On a recruté dans le Grand Banjul, une région où habitent des personnes dont le taux d’incidence de tuberculose à bacilloscopie positive nouvellement diagnostiquée est de ~ cas par an et par population Les patients inclus avaient des échantillons d’expectoration positifs à l’acide. -les bacilles par la coloration de Ziehl-Neelsen et qui ont poussé M tuberculosis en culture Leurs contacts familiaux ont été inclus dans l’étude s’ils étaient âgés de ⩾ mois et vivaient la plupart du temps sur le même composé que le patient. ils ont été traités pour la tuberculose l’année dernière et ils ont été exclus de l’étude s’ils ont reçu un diagnostic de tuberculose un mois après le recrutement. Les contacts ont été invités à donner leur consentement éclairé, interrogé et examiné, et un échantillon sanguin a été obtenu. ELISPOT et dépistage du VIH Des échantillons frais de tous les participants ont été traités sur place. Un maximum de contacts par jour ont été examinés; les autres contacts ont été exclus au hasard. Les contacts ont subi un test cutané PPD TU, PPD RT; Statens sérum Institut induration a été enregistré à – h Les sujets avec un résultat positif au test cutané moyen diamètre induration, ⩾ mm ont eu la possibilité de subir une radiographie thoracique, et ceux présentant des symptômes ont subi une évaluation clinique Ceux qui ont la tuberculose ont été référés au traitement libre Il n’existe aucune pratique actuelle de traitement préventif en Gambie Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique du gouvernement de Gambie / Medical Research Council Procédures de laboratoire Les frottis d’expectoration ont été préparés et colorés avec de l’auramine phénol , et les résultats ont été confirmés par Ziehl- Coloration de Neelsen Des échantillons décontaminés ont été inoculés dans la pente de chacun des milieux Lowenstein-Jensen contenant du glycérol et du pyruvate de sodium respectivement et un flacon de milieu BACTEC MB pour l’isolement de la tuberculose M. Toutes les cultures mycobactériennes ont été identifiées et confirmées par des procédures standardLes tests ELISPOT ex vivo pour l’IFN-γ ont été effectué comme décrit ailleurs Pour thi s étude, synthétiques, peptides séquentiels couvrant la longueur de ESAT et CFP-ABC; Imperial College ont été utilisés Chaque peptide était long acides aminés et chevauché son peptide adjacent par des résidus ESAT et CFP-peptides, utilisés à μg / mL, ont été divisés chacun de manière égale et séquentielle dans des pools de peptides PPD M tuberculose, RT; Statins Serum Institut a été utilisé à la concentration de μg / mL. Le témoin positif était PHA de phytohémaglutinine; Sigma-Aldrich Tous les antigènes ont été testés dans des puits en doubleAssays ont été notés par un compteur ELISPOT AID-GmbH Les puits positifs ont été prédéfinis comme contenant plus d’unités SFU + et au moins deux fois plus de puits témoins négatifs Pour un ESAT positif – / CFP- résultat, il était nécessaire que ⩾ pool de peptides chevauchants ait un résultat positif. Les puits témoins positifs pour la PHA ont été fixés à ⩾ SFU au-dessus des puits témoins négatifs. Les puits témoins négatifs devaient avoir & lt; Les tests quantitatifs ont été représentés comme des SFU au-dessus du contrôle négatif. Les tests de dépistage du VIH ou du VIH ont été effectués par des tests ELISA compétitifs Wellcome Laboratories et Western blot Test Diagnostic PasteurAvis d’exposition Selon les études précédentes en Gambie , les contacts TB ont été catégorisés selon où ils dormaient: dans la même chambre que le patient, dans une autre chambre de la même maison ou dans une autre maison Gestion et analyse des données Le nombre de SFU dans chaque puits était automatiquement saisi dans une base de données Access Microsoft utilisant Matlab MathWorks Des données supplémentaires ont été ajoutées par double saisie par des immunologistes qui ont ignoré les détails du sujet et les entrées ont été vérifiées. Toutes les autres données ont été saisies à l’aide d’une double saisie de données. comme un effet aléatoire, a été adapté aux mesures quantitatives transformées racine carrée Toutes les autres vari Les variables ont été ajustées en tant qu’effets fixes, et la signification à travers la proximité a été quantifiée, en tenant compte des effets de facteurs de confusion possibles. Toutes les analyses statistiques ont été effectuées en utilisant le logiciel Stata, version Stata.

Résultats

De mai à novembre, des contacts sains de patients atteints de tuberculose à bacilloscopie positive ont été recrutés pour notre étude. Parmi ceux-ci, ELISPOT a été sélectionné pour IFN-γ, et% d’entre eux avaient des critères d’inclusion. Résultats des tests cutanés L’âge médian des patients était de l’ordre des années, les années,% des patients étaient des hommes et% des patients testés pour l’infection VIH avaient des résultats positifs L’âge médian des contacts était de plusieurs années, mois à années, et% Nous n’avons trouvé aucune preuve que les sujets qui suspectaient être séropositifs se sont exclus de l’étude, car un taux de positivité de ~% est cohérent avec les études de surveillance sentinelle pour la population Globalement, les sujets% avaient un score ESAT / CFP positif – Résultats d’ELISPOT

Caractéristiques de contacts des patients atteints de tuberculoseTarifactation des contacts des patients atteints de tuberculoseLes résultats du test cutané PPD quantitatif et du test ELISPOT PPD, selon l’évidence de la récente infection M tuberculosis, ont révélé que les sujets ayant eu des résultats positifs ESAT / CFP ont eu tendance avoir un compte ELISPOT de PPD plus élevé et une plus grande induration de la réaction de test cutané que ceux qui avaient des résultats négatifs P & lt; pour les deux analyses Ces données montrent une association entre l’exposition récente à la tuberculose M et une réponse immunitaire élevée à la PPD, mesurée par la numération ELISPOT ou la réaction au test cutané.

Figure View largeTélécharger slide ELISPOT dosé par immunoessai enzymatique et diamètre d’induration du test cutané PPD, par réponse aux peptides spécifiques à Mycobacterium tuberculosis A, ELISPOT compte les unités formatrices de spot [SFU] / puits / × en réponse à la PPD chez les sujets avec des réponses négatives à cible antigénique sécrétoire précoces ESAT- et protéine de filtrat de culture CFP-peptides n = B, PPD test cutané diamètre d’induration pour les sujets réponses négatives aux peptides ESAT- et CFP- n = C, ELISPOT compte chez les sujets ayant des réponses positives à ESAT- et CFP- peptides n = D, diamètre d’induration du test cutané PPD chez les sujets ayant des réponses positives aux peptides ESAT et CFP- n = Les résultats quantitatifs ELISPOT ont été coupés à SFU par puits au-dessus du bruit de fond; par conséquent, les résultats ne sont pas présentés pour les sujets avec des comptes & gt; Les SFUs par puits de ces sujets ont eu des réponses positives aux peptides ESAT et CFPFigure View largeTélécharger la diapositiveLimmunospot immunoenzymatique dénombre les scores ELISPOT et le diamètre d’induration du test cutané PPD, par réponse aux peptides spécifiques à Mycobacterium tuberculosis A, l’ELISPOT compte les unités formant des taches [SFUs ] / puits / × en réponse à PPD chez des sujets ayant des réponses négatives à la cible antigénique sécrétoire précoce ESAT- et protéine de filtrat de culture CFP-peptides n = B, PPD test cutané diamètre d’induration pour les sujets réponses négatives aux peptides ESAT et CFP- n = C, ELISPOT compte chez les sujets avec des réponses positives aux peptides ESAT et CFP n = D, diamètre d’induration du test cutané PPD pour les sujets avec des réponses positives aux peptides ESAT et CFP n = Les résultats quantitatifs ELISPOT ont été coupés à SFU par puits au-dessus du fond; par conséquent, les résultats ne sont pas présentés pour les sujets avec des comptes & gt; Les SFUs par puits de ces sujets ont eu des réponses positives aux peptides ESAT et CFP. L’exposition des contacts de cas à M tuberculosis a été classée par proximité du sommeil à un patient avec un cas de TB Des contacts avec résultats positifs ESAT- / CFP-ELISPOT,% dormant dans la même pièce qu’un patient atteint de TB,% dormaient dans une pièce différente dans la même maison et% dormaient dans une maison différente sur le même composé. Lorsque les valeurs quantitatives ELISPOT PPD et test cutané PPD étaient analysées en fonction de l’exposition Les résultats d’ESAT- / CFP-ELISPOT montrent que le nombre d’ELISPOT de PPD a augmenté significativement en fonction du niveau d’exposition à M tuberculosis figure A; P =, en tenant compte des effets de l’appartenance ethnique, du sexe, de l’âge et du regroupement des ménages, mais aucune relation de ce type n’a été trouvée pour les résultats du test cutané PPD figure B

Figure View largeDownload slideAssemblage immuno-enzymatique PPD enzymatique Résultats ELISPOT Résultats de test cutané A; n = et PPD B; n =, par catégorie d’exposition Mycobacterium tuberculosis, chez des sujets ayant des réactions positives à la cible antigénique sécrétoire précoce et à la protéine filtrée en culture valuesFigure View largeTélécharger slideQuantitative PPD dosage immuno-enzymatique PPD résultats ELISPOT A; n = et PPD résultats de tests cutanés B; n =, par Mycobacterium tuberculosis catégorie d’exposition, chez les sujets avec des réactions positives à précoces antigène sécrétoire cible et culture filtrat protéines lignes horizontales, médiane valeurs Aucune interaction significative n’a été trouvée entre les variables En ce qui concerne les réponses quantitatives aux antigènes individuels M tuberculosis chez les sujets ayant des résultats positifs, une tendance similaire a été observée chez les sujets ayant des réponses positives aux sujets ESAT avec des résultats positifs; P =; Par souci d’exhaustivité, nous avons également évalué les données quantifiables sur les tests cutanés de la PPD en fonction de l’historique d’exposition chez les patients ayant un résultat positif au test cutané PPD avec des résultats positifs. l’utilisation d’un point de coupure d’induration mm et n’a trouvé aucune induration moyenne médiane de mm, mm et mm, respectivement, à travers le gradient d’exposition croissante; données non affichées

Discussion

Les résultats présentés ici fournissent une analyse de la réponse immunitaire quantitative à l’exposition naturelle à la tuberculose M dans un contexte endémique dans & gt; Ces résultats fournissent de nouvelles informations qui s’ajoutent aux analyses qualitatives publiées dans notre rapport précédent Les résultats quantitatifs du test PPD étaient significativement plus élevés pour les sujets qui étaient ESAT- / CFP- positif que pour ceux qui étaient ESAT- / CFP- négatifs Cela était vrai si la réponse à PPD a été mesurée par ELISPOT ou par test cutané Lorsque les résultats des tests PPD quantitatifs de sujets positifs à l’ESAT / CFP ont été comparés à travers un gradient naturel d’exposition, le test ELISPOT a révélé une relation positive dose-réponse immunitaire, alors que le test cutané n’a montré aucune relation de ce type. A notre connaissance, c’est la première fois qu’une relation dose-réponse immunitaire a été démontrée. tout organisme infectant, et ces résultats fournissent des preuves de l’utilité du test ELISPOT au-delà d’un gain de spécificité pour le diagnostic de l’infection à M tuberculosis Le concept d’utilisation de la proximité du sommeil comme mesure d’exposition remonte au moins à un rapport classique de Glover , publié en, qui traitait des taux de porteurs de méningocoques. Le gradient de proximité du sommeil s’est avéré à la fois reproductible et fiable nausées et vomissement de l’enfant. La Gambie Parce que le modèle est naturel, il y aura un certain nombre de variables environnementales Nous surmontons ce “bruit” de fond en analysant un grand nombre de contacts de cas.Pour quantifier la réponse à l’organisme entier sans perdre de spécificité, nous avons réalisé les analyses ELISPOT en utilisant une combinaison “inverse” qui combinait des réponses qualitatives spécifiques à l’antigène avec celles qui étaient quantitatives et non spécifiques. La première combinaison identifiait des individus susceptibles d’être infectés par M tuberculosis, ceux ayant une réponse positive à ESAT- / CFP – les peptides, et le second énuméré par une réponse à PPD L’évaluation des réponses PPD a également permis Une comparaison directe entre les réponses immunitaires de la peau et des compartiments sanguins utilisant le même test antigénique. L’ELISPOT ex vivo est spécifique des lymphocytes récemment activés avec un phénotype effecteur / mémoire qui décroît au fur et à mesure que l’antigène est éliminé. ex vivo des cellules sensibles peuvent être la clé de la sensibilité à la charge infectieuse récente qui manque dans la réaction de test cutané Une telle fonction, au-delà d’un test qualitatif, oui ou non pour l’infection, a plusieurs applications possibles importantes Par exemple, une différence globale relative La fréquence d’ELISPOT entre les receveurs et les patients recevant le placebo pourrait fournir une indication précoce de la protection dans les essais d’efficacité vaccinale, soit contre une nouvelle infection chez les patients ayant une TB connue après vaccination prophylactique, soit contre une infection existante. va diminuer rapidement et de manière fiable avec su Nous avons débuté un essai randomisé pour évaluer la réversion d’ELISPOT avec un traitement à l’isoniazide chez des contacts de patients tuberculeux en Gambie. Une petite étude impliquant des patients atteints de tuberculose a montré des résultats prometteurs à cet égard . l’efficacité aiderait grandement dans l’évaluation de nouvelles interventions La complexité de l’interaction organisme-hôte inclut des facteurs d’organisme, tels que les différences de virulence entre les souches d’organismes et, comme montré dans cette étude, les différences dans la charge infectieuse reçue. la force de la réponse immunitaire à une infection récente pourrait être un facteur prédictif d’évolution vers la maladie Nos résultats indiquent que la charge infectieuse doit maintenant être prise en compte dans les études longitudinales qui répondent à cette question. une mesure de la quantité d’exposition à un patient index doit être obtenue lors de l’évaluation quantitative La réponse immunitaire à une infection récente par M tuberculosis en relation avec le développement ultérieur d’une maladie secondaire Comme les caractéristiques immunologiques de la protection contre la tuberculose sont définies, il est important d’utiliser les meilleurs outils disponibles Précision améliorée dans la mesure quantitative de la réponse immunitaire aux infections récentes est possible grâce à un test fonctionnel des cellules T qui mesure une composante transitoire de la réponse immunitaire. Cela offre de nouvelles possibilités pour l’évaluation de l’efficacité de nouvelles interventions contre la tuberculose et de nouvelles considérations pour ceux qui évaluent la réponse immunitaire initiale à la tuberculose. à la maladie Ces résultats sont également pertinents pour les études d’interventions contre d’autres grandes maladies infectieuses

Remerciements

Nous remercions les sujets de l’étude, le personnel de terrain et de laboratoire des laboratoires du CRM et le programme national de lutte contre la lèpre et la tuberculose en Gambie. Le Dr Michel Klein et les professeurs Hilton Whittle et Sarah Rowland-Jones ont fourni des commentaires utiles. Research Council Royaume-Uni et la Commission européenne AFTBVAC, subvention QLRT–; VACSEL, octroi de conflits d’intérêts ICFPAPRP RHB a un brevet relatif à ELISPOT ex vivo sous licence à l’Université d’Oxford Tous les autres auteurs: no conflicts