Utilisation de la microscopie à fluorescence à diode électroluminescente pour détecter les bacilles acido-résistants dans les expectorations

Contexte La microscopie par fluorescence offre des avantages bien décrits par rapport à la microscopie optique conventionnelle pour l’évaluation des frottis d’expectoration pour la tuberculose. Cependant, son utilisation dans des contextes à ressources limitées a été limitée par le coût élevé de la source lumineuse excitatrice. MVPMethods Des échantillons d’expectorations recueillies régulièrement chez des personnes soupçonnées d’avoir la tuberculose dans des cliniques communautaires ont été colorées avec de l’auramine O et ont été évaluées à l’aide de différentes sources lumineuses excitatrices MVP et LED; ces échantillons ont ensuite été colorés et réexaminés par microscopie optique. Deux microscopistes ont indépendamment évalué tous les frottis. La culture bactérienne a fourni l’étalon-or. Résultats Des échantillons d’expectoration évalués,% étaient positifs pour Mycobacterium tuberculosis par culture La sensibilité et la spécificité documentées pour les différentes modalités étaient% et %, respectivement, pour l’évaluation des DEL; % et%, respectivement, pour l’évaluation MVP; et% et%, respectivement, pour la microscopie optique Κ valeurs pour la variation de l’interreader étaient pour l’évaluation LED, pour l’évaluation MVP, et pour la microscopie optique Le temps moyen de lire un frottis négatif était min avec microscopie à fluorescence et min avec microscopie optique, reflétant une économie de temps de% avec la microscopie à fluorescenceConclusion La microscopie à fluorescence LED fournit une alternative fiable aux méthodes conventionnelles et a de nombreux attributs favorables qui facilitent les services de diagnostic décentralisés améliorés

La microscopie des frottis d’expectoration est le seul test diagnostique disponible dans la plupart des pays à ressources limitées pour l’évaluation des patients présentant des symptômes évocateurs de tuberculose pulmonaire. Depuis la description initiale de la technique de microscopie à fluorescence auramine O par Hagemann , de nombreux rapports confirment Dans une revue systématique des études, Steingart et al ont rapporté que la microscopie à fluorescence de frottis colorés à l’auramine fournit une spécificité similaire et une sensibilité accrue signifie une amélioration de% de la performance de la microscopie par fluorescence. comparé à la microscopie optique des frottis colorés au ZNEn plus d’une sensibilité accrue, la microscopie à fluorescence permet également un criblage plus rapide des frottis d’expectoration. D’un point de vue opérationnel, ceci est très avantageux, en particulier lorsqu’un grand nombre d’échantillons est criblé par jour. la majorité du temps de laboratoire est passé confirmin g résultats de frottis négatifs Selon les directives techniques de l’Union Internationale contre la Tuberculose et les Maladies Respiratoires pour la microscopie des expectorations, un minimum de dépistage est nécessaire pour identifier correctement un résultat de frottis négatif lorsque la microscopie optique conventionnelle est utilisée. Le temps passé par diapositive est souvent bien inférieur au minimum requis Une étude opérationnelle du Cameroun a démontré un examen microscopique médian des crachats de seulement min. Près de% des cas détectés par une évaluation minutieuse ont été manqués durant les investigations de routine , démontre qu’une microscopie optique conventionnelle peut avoir un impact sur la détection précoce des cas et le retard diagnostique Une étude comparative a montré qu’un examen microscopique à fluorescence permettait d’obtenir une sensibilité plus élevée et une spécificité équivalente à celle d’un examen microscopique conventionnel. de min Malgré le fonctionnement claira La microscopie optique conventionnelle reste le test de diagnostic le plus largement utilisé dans les pays à ressources limitéesLa principale raison pour laquelle la microscopie à fluorescence n’est pas utilisée est la durée de vie limitée – h et le coût élevé de la lampe à vapeur de mercure à arc court MVP, qui a traditionnellement été utilisé comme source lumineuse excitatrice Une commutation répétée, comme cela peut se produire avec une alimentation locale non fiable, réduit encore la durée de vie En outre, les MVP sont inefficaces et nécessitent une alimentation électrique importante; ils peuvent aussi échouer de manière catastrophique et libérer du mercure toxique dans l’environnement Les microscopes à fluorescence fournis par les agences donatrices tombent souvent en désuétude en raison des coûts de maintenance élevés La diode électroluminescente fournit une source de lumière fiable et bon marché. ,, h; la commutation répétée ne réduit pas sa durée de vie utile et ne présente pas de risque potentiel de toxicité Des études initiales ont montré que la microscopie à fluorescence LED, utilisant une lumière LED bleu royal, constitue une alternative valable au MVP [ ,], mais les données concernant son utilisation diagnostique restent limitées La variabilité entre lecteurs et les considérations de mise en œuvre n’ont pas été évaluées dans des conditions de routineNotre étude a évalué les performances diagnostiques de la microscopie à fluorescence auramine O avec utilisation d’une source lumineuse excitatrice à LED. les deux modalités de fluorescence ont été comparées à la microscopie optique conventionnelle des frottis colorés au ZN. La culture mycobactérienne a fourni l’étalon-or

Méthodes

Nous avons réalisé une étude transversale en laboratoire. Des échantillons d’étude consécutifs ont été prélevés chez des patients adultes suspectés de tuberculose pulmonaire qui fréquentaient régulièrement des cliniques de soins de santé primaires à Cape Town, Afrique du Sud. Les frottis ont été préparés à partir d’échantillons d’expectorations prélevés au cours d’une période d’étude d’avril à juin. Des procédures standard ont été effectuées pour la décontamination et la concentration des échantillons, la préparation des lames et la coloration au fluorochrome avec l’auramine O . a une affinité pour l’acide mycolique contenu dans les parois cellulaires des mycobactéries. Avec la coloration à l’auramine O, les mycobactéries apparaissent sous la forme de bâtonnets fluorescents jaunes vifs sous une source lumineuse excitatrice. L’auramine O est excitée par la lumière bleue et émet dans le vert. longueur d’onde de gamme jaune, – nm La source de lumière LED bleu royal utilisé mÅ, W, Royal Blue Luxeon emitte r; Philips Lumileds Lighting Company a un maximum d’absorption de nm, qui correspond au maximum d’absorption de l’auramine OFigure fournit une vue d’ensemble des procédures de collecte et d’évaluation des spécimens Les lames de recherche ont été préparées par lots de – spécimens par semaine. microscopistes indépendants; les lames ont d’abord été lues avec le MVP, puis lues avec la source lumineuse LED. Un oculaire avec un grossissement x et un objectif avec grossissement x grossissement total, × ont été utilisés Les microscopistes ont été aveuglés à tous les résultats précédents. et des formes de capture de données séparées ont été utilisées pour chaque modalité afin d’éliminer la possibilité de la première lecture influençant la seconde Après l’achèvement de la microscopie à fluorescence, la même lame a été colorée au ZN selon la méthodologie standard , et la lame colorée a été évaluée microscope Comme recommandé par le guide technique de l’Union Internationale contre la Tuberculose et les Maladies Respiratoires, les champs ont été couverts avec la méthode du battlement, avec un oculaire avec grossissement × et un objectif d’immersion dans l’huile avec grossissement × grossissement × ×] après coloration initiale à l’auramine O ne devrait pas affecter le résultat et est acceptée pratique standard SH Siddiqi, communication personnelle Toutes les évaluations ont été réalisées en une journée Le nombre de bacilles acidorésistants observés a été quantifié selon les directives du Centre de contrôle et de prévention des maladies aucun ajustement n’a été fait pour la légère différence de grossissement entre fluorescence × et lumière ± microscopie Les spécimens ont été cultivés en routine à des fins de recherche; en raison des considérations de coût, les échantillons pour lesquels le résultat du frottis diagnostique de routine a été trouvé positif ont été cultivés dans du milieu liquide H bouillon avec l’utilisation des systèmes de diagnostic BD automatisés de système de tube mycobactérien de croissance et des frottis pour lesquels les résultats de les frottis de diagnostic de routine étaient négatifs ont été cultivés sur milieu solide Löewenstein-JensenAnonyme, les données non liées ont été saisies dans une feuille de calcul Excel Microsoft Descriptive et des analyses de données comparatives ont été effectuées en utilisant Stata, version StataCorp; Les IC% pour les statistiques κ ont été calculés en utilisant la méthode bootstrap. La sensibilité, la spécificité et l’accord interreader ont été comparés entre toutes les modalités, avec la culture comme norme d’excellence L’approbation éthique a été accordée par le Committee for Human Research, Université de Stellenbosch

RÉSULTATS

Parmi les échantillons d’expectoration évalués,% ont été confirmés positifs pour Mycobacterium tuberculosis par culture Le tableau montre le rendement des échantillons positifs pour les frottis d’expectoration identifiés avec chacune des modalités diagnostiques évaluées Le rendement obtenu avec le microscope à fluorescence le rendement obtenu en microscopie optique [%] des spécimens par rapport à [%] des spécimens; OU, ; % CI, -, mais la différence n’était pas statistiquement significative Les rendements obtenus avec la microscopie fluorescente utilisant différentes sources lumineuses excitatrices MVP et LED étaient comparables [%] des spécimens vs [%] des spécimens; OU, ; % IC, – La sensibilité et la spécificité atteintes avec les différentes modalités étaient respectivement de% et% pour l’évaluation LED; % et%, respectivement, pour l’évaluation MVP; et% et%, respectivement, pour la microscopie optique des frottis colorés au ZNTableau montre le nombre de résultats de frottis positifs identifiés par chaque microscopiste, en plus des résultats divergents et des valeurs κ pour la variabilité des interlocuteurs La concordance des interlocuteurs était plus élevée avec l’utilisation de la microscopie à fluorescence LED ,, bien que les% IC de toutes les modalités se chevauchent Les microscopistes ne lisent chaque lame qu’une seule fois; par conséquent, la variabilité intrareader n’a pas pu être calculée avec la microscopie à fluorescence, le temps moyen pour lire un résultat de frottis négatif était min; aucune différence n’a été notée entre la LED et la MVP Avec la microscopie optique conventionnelle, le temps moyen passé à lire un résultat de frottis négatif était min, ce qui démontre des gains de temps de% en microscopie à fluorescence

DISCUSSION

Ces résultats ne sont pas statistiquement significatifs, la plus grande sensibilité et la plus faible variabilité ont été obtenues avec la microscopie à fluorescence LED. Cette découverte est importante car la disponibilité d’une source lumineuse excitatrice robuste et peu coûteuse rend la microscopie fluorescente plus réalisable dans les milieux restreints. La faible consommation d’énergie de la microscopie à fluorescence LED offre des perspectives pour le développement de microscopes à fluorescence fonctionnant sur batterie qui peuvent être utilisés dans des zones où l’alimentation électrique est faible ou inexistante. Bien que l’idée n’ait pas été formellement évaluée au cours de l’étude, les microscopistes ont remarqué qu’avec la source de lumière LED, les mycobactéries restaient facilement visibles malgré l’absence d’un environnement sombre. Les microscopistes sont généralement conseillés d’effectuer la fluorescence la microscopie dans un environnement sombre L’observation selon laquelle un environnement assombri n’est pas nécessaire nécessite une évaluation plus approfondie, mais si elle est justifiée, cela augmenterait considérablement la faisabilité pratique de l’utilisation de la microscopie à fluorescence à LED. Fournir des services diagnostiques décentralisés Il a été démontré que ces services améliorent la détection des cas et réduisent les retards diagnostiques, en particulier dans les zones rurales et isolées. Une étude précédente a observé que plus de frottis “rares” ont été observés. ceci a été potentiellement attribué au photoblanchiment de la coloration de l’auramine O après l’exposition au MVP Il est peu probable que le photoblanchiment ait influencé nos résultats; des lots de frottis colorés à l’auramine O ont été lus le même jour, et il n’y avait aucune différence entre le nombre de frottis rares détectés avec les modalités frottis rares avec le MVP et frottis rares avec le LED En fait, une proportion accrue de frottis positifs ont été détectés avec l’évaluation LED, comparés aux échantillons MVP [%] vs [%], et l’évaluation LED a été réalisée après l’exposition MVP Le rendement amélioré n’était pas statistiquement significatif, mais nous pouvons conclure que la microscopie à fluorescence LED n’est pas moins plus sensible que la microscopie avec la culture MVPSputum traditionnelle est largement considéré comme le test le plus sensible, c’est-à-dire l’étalon-or pour la détection de la tuberculose pulmonaire, mais son utilisation systématique dans des contextes à ressources limitées est entravée par des coûts excessifs. nécessité d’une infrastructure de laboratoire adéquate En pratique, amélioration de l’évaluation directe des échantillons d’expectorations résultant d’une amélioration de la sensibilité et / ou de l’amélioration L’accès aux services diagnostiques décentralisés reste hautement pertinent Il existe un besoin certain d’améliorer l’accès à la culture des expectorations pour établir la sensibilité aux médicaments dans les régions où les taux de tuberculose pharmacorésistante sont élevés et chez les patients infectés par le VIH qui ont des frottis d’expectoration négatifs. pour les résultats de frottis rapides et le traitement efficace des cas de tuberculose les plus infectieux reste primordial; en outre, la microscopie à fluorescence semble être plus efficace que la microscopie optique pour la détection de la tuberculose chez les patients infectés par le VIH avec une maladie paucibacillaire Notre étude a été limitée par de petits nombres et n’a pas montré de différences statistiquement significatives. suffisamment pour démontrer que la microscopie à fluorescence LED offre une alternative hautement réalisable avec des performances diagnostiques au moins similaires aux méthodes conventionnelles. Un seul milieu de culture a été utilisé pour chaque spécimen. Par conséquent, toutes les modalités ont été systématiquement évaluées par rapport au test standard d’or identique. La performance de la coloration ZN sur la même lame initialement colorée à l’auramine O aurait pu affecter la sensibilité de la coloration ZN. considéré comme improbable et accepté comme pratique standard Malgré cette réserve potentielle, il a été décidé d’évaluer les différentes modalités en utilisant la même diapositive pour assurer une comparaison optimale, car les différentes lames préparées à partir du même spécimen peuvent être très variables. En conclusion, notre étude ajoute à l’ensemble des preuves que la microscopie à fluorescence LED offre une alternative valable aux méthodes conventionnelles Son faible coût, sa robustesse, son efficacité énergétique et son efficacité perçue en l’absence d’un environnement sombre sont des attributs très favorables À court terme, la microscopie optimisée offre l’option la plus réaliste dans des contextes à ressources limitées; des essais de terrain à grande échelle sont nécessaires pour évaluer les avantages et la faisabilité du remplacement de la microscopie optique conventionnelle au ZN par la microscopie à fluorescence à LED comme test de diagnostic de première intention

Reconnaissance

Nous remercions les cliniques de soins de santé primaires impliqués, pour aider à la collecte des expectorations, et le Dr Ivan Toms Ville du Cape Town Health Service et le National Health Laboratory Service, de nous avoir permis de mener l’étude des conflits d’intérêts potentiels.

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