Association entre l’ADN circulant, le sérum 1 → 3-β-d-glucane et la charge fongique pulmonaire dans la pneumonie à Pneumocystis

L’ADN de Pneumocystis jirovecii circulant et le 1 → 3-β-d-glucane déterminé dans 70 échantillons sériques de patients immunodéprimés ont été comparés à la charge fongique dans les liquides de lavage broncho-alvéolaire évalués en utilisant une réaction en chaîne par polymérase quantitative. Les deux biomarqueurs sériques sont influencés par la charge fongique pulmonaire. pris en compte lors du diagnostic de l’infection à Pneumocystis

Pneumocystis pneumoniae PCP, causée par le champignon opportuniste Pneumocystis jirovecii, est généralement diagnostiquée au moyen de l’observation microscopique de kystes P jirovecii ou formes trophiques sur des lames préparées en utilisant bronchoalvéolaire lavage liquide BAL [1] Cependant, des tests sériques pour PCP ont également été développés pour non conforme patients ou trop fragiles pour les procédures invasives Le test β-glucane 1 → 3-β-d-glucan a été utilisé pendant plusieurs années comme alternative non invasive au diagnostic microscopique [1] Le β-glucane est un antigène commun de la cellule. paroi dans la plupart des champignons et un composant structurel principal de la paroi cellulaire dans les kystes P jirovecii [1] La performance des tests β-glucane est généralement évaluée par rapport à la microscopie positive et la présentation clinique compatible comme l’étalon-or [2, 3] réaction quantitative en chaîne par polymérase Les dosages qPCR sont de plus en plus utilisés pour le diagnostic en raison de la faible probabilité de résultats faussement positifs en raison du format du tube qPCR a le potentiel de remplacer la microscopie pour diagnostiquer la PCP si des seuils quantitatifs peuvent être définis Pour évaluer l’association entre l’ADN circulant, le β-glucane sérique et la charge fongique pulmonaire dans le PCP, nous avons testé des échantillons de sérum lors du développement de notre test qPCR pour la détection de l’ADN de P jirovecii dans les fluides BAL [4]

Méthodes

Dans le cadre d’une étude rétrospective de cohorte hospitalière monocentrique impliquant tous les patients subissant une BAL pour étudier la cause de la pneumonie [4], nous avons examiné des échantillons de sérum concomitants soumis au laboratoire à des fins autres que le diagnostic de PCP détectant principalement des antigènes ou des anticorps. Cette étude a été approuvée par le comité d’éthique de l’hôpital Henri Mondor IMCJ-H20-569 La procédure BAL et la qPCR des liquides BAL ont été réalisées comme indiqué ailleurs [4] Microscopique le diagnostic comprend l’identification de P jirovecii sur des lames préparées à partir de fluide BAL et colorées en utilisant un dosage par immunofluorescence indirecte kit Monofluo P jirovecii, Bio-Rad, Marnes la Coquette, des échantillons FranceSerum ont été stockés à -40 ° C dans le cadre de la procédure de routine Après décongélation, le sérum Les taux de β-glucane ont été mesurés à l’aide du test de Fungitell. Associés de Cape Cod, Inc, Cape Cod, Massachusetts Manipulation a été réalisée conformément aux instructions du fabricant. Les résultats de ß-glucane ont été catégorisés soit positifs> 80 pg / ml ou négatifs <80 pg / ml, avec des valeurs> 500 pg / ml étant censurées à 500 pg / ml. En parallèle, l’ADN a été extrait à partir de 1 mL de sérum en utilisant la procédure d’extraction LV Total Acide Nucléique sur l’instrument MagNA Pure Compact Roche Diagnostics, Meylan, France Enfin, l’ADN a été élué dans 50 μL de tampon d’élution Réaction PCR Le test qPCR ciblait le gène mtLSU, incluant la prévention enzymatique de la contamination par contrôle interne et la quantification des copies avec un plasmide personnalisé [4]. Le test exact de Fisher et le test χ2 ont été utilisés pour comparer les variables catégorielles. variables continues Les différences ont été considérées comme significatives à P & lt; 05 Les analyses statistiques ont été effectuées en utilisant Prism 40 GraphPad Software

RÉSULTATS

Un total de 70 échantillons de sérum ont été prélevés chez 63 patients, avec 1 patient ayant 4 BAL et 4 patients 2 BAL intervalles médians, 16 jours; intervalle, 15-318 Les échantillons ont été divisés en 3 groupes selon les résultats de la microscopie et du qPCR BAL: groupe 1 représenté par microscopie positive et qPCR positive, groupe 2 par microscopie négative et qPCR positif, et groupe 3 par microscopie négative et qPCR -négatif Tableau 1 L’intervalle de temps entre le sérum et l’échantillonnage BAL n’a pas significativement différé entre les 3 groupes Les échantillons d’un même patient ont été répartis de façon égale parmi les 3 groupes Tableau 1

Tableau 1Serum Pneumocystis jirovecii ADN et β-d-glucan β-Glucan Titres selon microscopie et P jirovecii Résultats de la réaction en chaîne de polymérase quantitative de 70 échantillons de lavage broncho-alvéolaire de 63 Patientsa Groupe 1: Microscopie positive, qPCR-Positive BAL n = 10, Non % Groupe 2: Microscopie-Négatif, qPCR-Positif BAL n = 26, No% Groupe 3: Microscopie-Négatif, qPCR-Négatif BAL n = 34, Non% P Valeur Conditions comorbides SIDA n = 8, 11% 5 50 1 4 2 6 Leucémie aiguë n = 28, 40% 2 20 12 46 14 41 Affections lymphoprolifératives chroniques n = 8, 11% 0 2 8 6 18 Transplantation d’organes pleins n = 11, 16% 2 20 3 11 6 18 Maladies inflammatoires systémiques n = 11, 16% 1 10 7 27 3 9 Cancer solide n = 2, 3% 0 1 4 1 3 Autre n = 2, 3% 0 0 2 6 Intervalle de temps entre l’échantillonnage du sérum et du BAL, jours SEM 10 088 -008 032 – 021 051 28 Non avec échantillon de sérum qPCR-positif% 9 90 0 0 & lt; 0001 Mean log10 BAL P jirovecii Copie d’ADN, No / μL SEM 46 034 11 020 … & lt; 0001 Non avec β-glucane> 500 pg / mL% 10 100 6 23 2 6 & lt; 0001 Non avec ß-glucane> 80 et ≤500 pg / mL % 0 19 73 8 24 & l 0001 Non avec β-glucane ≤80 pg / mL% 0 1 4 24 71 & lt; 0001 Non avec aspergillose invasive probable ou prouvée concomitante% 1 10 4 15 5 15 91 Schémas radiologiques diffus 10 10 7 27 7 21 19 Groupe 1: Microscopie-positive, qPCR-Positive BAL n = 10, No% Groupe 2: Microscopie-Négative, qPCR-Positive BAL n = 26, No% Groupe 3: Microscopie-Négative, qPCR-Négative BAL n = 34, Non% P Valeur Conditions comorbides SIDA n = 8, 11% 5 50 1 4 2 6 Leucémie aiguë n = 28, 40% 2 20 12 46 14 41 Affections lymphoprolifératives chroniques n = 8, 11% 0 2 8 6 18 Transplantation d’organes pleins n = 11, 16% 2 20 3 11 6 18 Maladies inflammatoires systémiques n = 11, 16% 1 10 7 27 3 9 Cancer solide n = 2, 3% 0 1 4 1 3 Autre n = 2, 3% 0 0 2 6 Temps dans terval entre le sérum et l’échantillonnage BAL, jours SEM 10 088 -008 032 -021 051 28 Non avec échantillon de sérum qPCR-positif% 9 90 0 0 & lt; 0001 Moyenne log10 BAL P jirovecii Copie d’ADN, No / μL SEM 46 034 11 020 … & lt; 0001 Non avec le β-glucane> 500 pg / mL% 10 100 6 23 2 6 & lt; 0001 Non avec le ß-glucane> 80 et ≤500 pg / mL% 0 19 73 8 24 & lt; 0001 Non avec β -glucane ≤80 pg / mL% 0 1 4 24 71 & 1 0001 Non avec aspergillose invasive probable ou prouvée concomitante% 1 10 4 15 5 15 91 Schémas radiologiques diffus 10 100 7 27 7 21 19 Abréviations: BAL, lavage broncho-alvéolaire; qPCR, réaction de polymérisation en chaîne quantitative; SEM, erreur-type de la moyenne Lorsque BAL a été réalisé plusieurs fois chez un patient donné, la distribution de l’échantillon était la suivante: 1 échantillon dans les groupes 1 et 3 pour 1 patient; 2 échantillons dans le groupe 1 pour 1 patient; 2 échantillons dans le groupe 2 pour 1 patient; 1 échantillon dans le groupe 2 et 3 échantillons dans le groupe 3 pour 1 patient; et 2 échantillons dans le groupe 3 pour 1 patient View LargeNine des 10 échantillons de sérum du groupe 1 étaient qPCR-positifs, avec un nombre de copies médian 103 fois plus faible, 119; 70-538 que dans le liquide BAL Le seul sérum qPCR-négatif de ce groupe correspond au BAL avec le nombre de copies le plus bas 33 copies / μL Le niveau de β-glucane était> 500 pg / mL pour les 10 échantillons de sérum et l’imagerie a montré modèles radiologiques diffus pour tous Les résultats de BAL dans le groupe 2 présentaient une charge fongique pulmonaire inférieure à celle du groupe 1, tous étant ≤3 log copies / μL Les échantillons sériques correspondants étaient tous qPCR-négatifs Six échantillons de sérum 231% avaient des taux de β-glucane 500 pg / mL pour BAL, avec un nombre moyen de copies de log de 2183 erreur-type de la moyenne [SEM], 0399 Dix-neuf 731 échantillons de sérum avec des niveaux de β-glucane> 80 et ≤500 pg / mL correspondaient à des BAL avec copie log moyenne inférieure de 08526 SEM, 0184 que les 6 échantillons BAL correspondant à β-glucane> 500 pg / mL P = 003 Seul 1 échantillon de sérum était β-glucan négatif 52 pg / mL dans ce groupe et correspondait au BAL avec le plus faible fardeau fongique 40 copies / μLIn groupe 3, 10 échantillons de sérum ont des niveaux de β-glucane & gt; 80 pg Le nombre d’aspergilloses invasives probables ou prouvées classées selon le groupe coopératif Organisation européenne de recherche et de traitement du cancer / Infections fongiques invasives et le groupe d’étude sur les mycoses de l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses [5] ne différait pas entre les trois groupes Aucune candidémie n’a été observée pendant l’intervalle de 10 jours avant ou après l’intervention. La sensibilité et la spécificité du β-glucane pour le diagnostic de PCP étaient de 10 intervalle de confiance à 95% [IC], 69-1 et 042 IC à 95%, 29- 55, respectivement, et 097 95% CI, 86-99 et 071 95% CI, 52-85, respectivement, quand la microscopie positive ou positive qPCR a été prise comme norme

DISCUSSION

Dans cet article, la détection de l’ADN circulant de P jirovecii en utilisant qPCR a été influencée par la charge fongique pulmonaire A condition que la charge pulmonaire soit de> 33 copies / μL, tous les 9 échantillons sériques étaient qPCR-positifs. La plupart des échantillons de sérum correspondant à des LBA microscopiques négatifs et à qPCR-positifs étaient positifs pour les β-glucanes. La détection de l’ADN de P jirovecii dans le sérum a déjà été étudiée, mais avec des résultats contrastés. Aucun ou très peu d’échantillons trouvé positif par PCR lorsque le diagnostic a été prouvé au microscope en utilisant des fluides BAL [6-9], ou des résultats PCR positifs ont été obtenus chez des patients qui n’étaient ni infectés ni colonisés par P jirovecii [6, 7, 9] n’incluaient pas de prévention enzymatique de la contamination et étaient des PCR nichées, des résultats faussement positifs ne peuvent pas être exclus pour les patients non-PCP [7, 9] De même, aucun contrôle interne n’a été utilisé, les résultats faux négatifs ne peuvent être exclus. En revanche, 2 études ont rapporté que presque tous les patients PCP testés avaient au moins 1 échantillon PCR-positif [10, 7, 9]. 11] Comme la norme pour le diagnostic était la microscopie, ces résultats sont en accord avec les nôtres. En effet, nous avons trouvé que le qPCR sérique positif correspondant aux charges fongiques pulmonaires était toujours associé à la microscopie positive [4] Méthode: Tous les patients ayant une charge pulmonaire élevée étaient positifs pour le virus de l’immunodéficience humaine, suggérant que la charge fongique, plutôt que la maladie sous-jacente, était la cause de la positivité du qPCR du sérumSerum β-glucane [1] Dans cet article , nous avons montré une association claire entre la charge fongique du BAL et les taux de β-glucane sérique, comme l’ont récemment rapporté de Ber et al [12] Cependant, des résultats faussement positifs peuvent survenir dans 35% des cas [3] , le β-glucane n’est pas spécifique du PCP, car il est inclus, par exemple, dans les critères de maladies fongiques profondes, telles que la candidose invasive et l’aspergillose invasive [5] Le nombre d’infections fongiques invasives n’explique pas les différences observées entre les les 3 groupes de notre étude Tableau 1 De plus, de nombreuses autres causes de résultats faussement positifs ont déjà été citées [1] Nos résultats suggèrent cependant une autre cause probable, qui n’a pas été étudiée dans des études antérieures, à savoir la présence de P jirovecii Si le diagnostic de PCP est basé sur une microscopie positive correspondant à un seuil de> 3 log copies / μL comme dans la présente étude, des échantillons sériques positifs pour le β-glucane avec un BAL inférieur à ce seuil doivent être considérés. fausse-positive Ainsi, la spécificité de β-glucane a diminué de 706% à 417% selon que les échantillons de LBA négatifs au microscopie et qPCR-positifs étaient considérés comme vrais-positifs ou faux-positifs Le taux élevé de faux positifs peut en effet résulter de la décision clinique d’exclure le diagnostic de PCP lorsque la microscopie est négative et qPCR positive [1, 3] Nous connaissons bien les limites de cette étude rétrospective sur les patients Une autre probabilité de pré-test peut biaiser la performance calculée, tout comme le faible nombre d’échantillons évalués. Un autre biais peut être la sélection des patients pour lesquels un seul échantillon de sérum simultané était disponible, bien que cela n’ait probablement pas conduit à un biais de sélection. Enfin, la cinétique des marqueurs sériques était inconnue, ce qui signifie qu’ils ont peut-être changé en quelques jours. Néanmoins, l’intervalle entre le sérum et la collection de liquide de BAL ne différait pas entre les 3 groupes d’échantillons. de l’ADN de β-glucane et de P jirovecii pourrait être utilement combiné en tant que marqueurs sériques pour le diagnostic de la PCP chez les patients atteints de maladies graves ou d’autres conditions précludi Dans le cadre de la procédure du BAL, d’autres études avec un échantillonnage sérique en série devraient permettre d’explorer le β-glucane et la cinétique de l’ADN après le traitement afin de déterminer s’ils peuvent aider les cliniciens dans l’évaluation de la thérapie.

Remarques

Remerciements Nous remercions le Dr Annie Sulahian d’avoir effectué les tests de β-glucanes et les cliniciens participants de l’hôpital pour leur collaboration dans la collecte d’échantillons de BAL et de sérum. Nous sommes également reconnaissants au Prof. Françoise Dromer pour la lecture critique de ce manuscrit. Aucun conflit signalé Tous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits d’intérêts potentiels Conflits que les éditeurs considèrent pertinents pour le contenu du manuscrit ont été divulgués