Réaction quantitative en chaîne de la polymérase en temps réel pour Escherichia coli entéropathogène: un outil pour l’investigation des infections asymptomatiques versus symptomatiques

Contexte Escherichia coli entéropathogène Les souches EPEC sont des agents pathogènes pédiatriques couramment isolés chez des enfants sains et malades atteints de diarrhée dans des zones d’endémicité Le but de cette étude était de comparer la charge bactérienne d’EPEC isolée d’échantillons de selles d’enfants avec et sans diarrhée informations communes. Cette méthode pourrait être un outil utile pour une étude plus approfondie de ce phénomène. Méthodologie EPEC a été détectée par réaction en chaîne par polymérase PCR de colonies isolées sur des plaques MacConkey d’enfants diarrhéiques et en bonne santé âgés de & lt; Pour standardiser la quantification par PCR quantitative en temps réel qRT-PCR, la corrélation entre le cycle de seuil de fluorescence et le nombre de copies du gène de l’intimine de EPEC E / a été déterminéeRésultats La limite de détection de la qRT-PCR était bactéries / mg selles La charge géométrique moyenne dans la diarrhée était de bactéries / mg% intervalle de confiance [IC], – bactéries / mg, comparé aux bactéries / mg% CI, – bactéries / mg chez les sujets témoins P = charge bactérienne significativement plus élevée enfants atteints de diarrhée que chez les sujets témoins chez les enfants mois d’âge vs bactéries / mg; P = et parmi les enfants avec EPEC comme seul pathogène vs bactéries / mg; P = Conclusions La charge EPEC mesurée par qRT-PCR est plus élevée chez les enfants diarrhéiques que chez les enfants en bonne santé qRT-PCR peut être utile pour étudier la relation entre la maladie et la colonisation dans les milieux d’endémicité

Escherichia coli entéropathogène Les souches EPEC comptent parmi les agents pathogènes les plus importants chez les enfants du monde entier, car ils sont fréquents et souvent associés à une maladie prolongée accompagnée du risque de malnutrition . Ces pathogènes induisent une histopathologie distincte appelée est caractérisée par le contact intime entre les bactéries et la surface épithéliale de l’entérocyte La protéine intimin eaeA, nécessaire à la lésion A / E, a été utilisée pour l’identification moléculaire de l’EPEC La prévalence moyenne actuelle d’EPEC dans les épisodes diarrhéiques pédiatriques La tendance est, bien que souvent non statistiquement significative, d’isoler plus fréquemment ce pathogène chez les enfants souffrant de diarrhée que chez les sujets témoins en bonne santé Récemment, dans une diarrhée de surveillance passive étude de cohorte impliquant des enfants péruviens, nous avons isolé EPEC avec une fréquence similaire à celle de l’enfant. Cependant, de nombreuses études ont établi la virulence de l’EPEC, et des progrès remarquables ont été réalisés pour identifier les déterminants de la virulence nécessaires à la médiation de la pathogenèse de ces infections Notre hypothèse était que la présence de symptômes L’objectif de cette étude était de développer, standardiser et valider un test qRT-PCR quantitatif en temps réel de polymérase en chaîne pour l’EPEC et de déterminer si la charge bactérienne est liée à l’état des symptômes

Méthodes

Patients et échantillons

Les patients et les échantillons inclus dans cette étude ont été sélectionnés à partir d’une étude de cohorte de surveillance de la diarrhée passive menée auprès d’enfants. Un total de spécimens de selles précédemment trouvés positifs pour l’EPEC par PCR de colonies isolées sur des plaques MacConkey de culture de selles ont été analysés dans cette étude. Tous les échantillons de selles ont été testés pour des gènes spécifiques de tous les pathotypes de E coli diarrhéique, y compris stx et sxt des E coli productrices de shigatoxines Nous avons exclu pour cette étude les échantillons positifs pour eaeA de shigatoxine stx et stx Cinquante-trois échantillons de selles provenaient de patients souffrant de diarrhée âgée & lt; mois et âgés de ≥ mois, et des échantillons de selles ont été prélevés chez des enfants sains choisis au hasard sans diarrhée une semaine avant ou après la collecte des échantillons de selles âgés de & lt; mois et âgés ≥ mois Vingt-six échantillons provenaient d’enfants ayant une co-infection ou une cocolonisation comprenant à la fois un EPEC et un autre pathogène entérique commun Campylobacter, E. coli entéro-agrégatif, E. coli entérotoxigène ou E. coli diffusant. Chez les enfants, les souches EPEC étaient les seules pathogène isolé de l’échantillon de selles Des échantillons de selles frais ont été collectés dans des récipients fermés et conservés à – ° C jusqu’à évaluation par PCR. La souche prototypique EPEC E / a été utilisée comme témoin positif pour la standardisation de la méthode quantitative. à partir des dossiers médicaux remplis par le personnel de l’étude au moment de la maladie Nous avons utilisé un score de Vesikari modifié pour déterminer la gravité d’un épisode diarrhéique associé à l’EPEC Le score maximal possible était: points, ou points sévères

Isolement de l’ADN de la culture et des échantillons de selles

L’ADN génomique a été isolé à partir d’une culture pure de la souche EPEC E /, cultivé pendant – heures à ° C, et extrait avec la méthode phénol-chloroforme. Dix dilutions en série équivalentes aux bacilles ont été préparées pour déterminer la limite de détection. Le génome de l’EPEC a des paires de bases équivalentes à fg et représente des copies de eaeA gen. L’ADN a été isolé à partir d’échantillons de selles en utilisant une méthode d’extraction au bromure de cétyltriméthylammonium modifiée à partir d’une méthode décrite ailleurs. μL de tampon de lyse% de dodécylsulfate de sodium dans l’acide M éthylènediaminetétraacétique [EDTA]; Le lysat a été incubé à ° C pendant des heures. Ensuite, on a ajouté un μL de chlorure de sodium NaCl NaCl, suivi de μL de% CTAB / M NaCl chauffé à ° C. mélangé, l’échantillon a été incubé à ° C pendant minutes. Ceci a été suivi par des extractions avec des volumes égaux de chloroforme puis de phénol-chloroforme isoamylalcool ::, et l’ADN a été précipité avec de l’éthanol glacé. Tampon EDTA et passé sur une colonne de centrifugation de nettoyage de l’ADN L’ADN a été finalement élue de la colonne de centrifugation dans un ul de tampon Tris-EDTAx; μL de cette solution d’ADN a été utilisé dans la PCR

Test de RT-PCR pour la quantification de l’EPEC E /

La PCR a été réalisée en utilisant un système de détection de PCR en temps réel iCycler IQ ™ Multicolor Bio-Rad, Californie suivi par une version de logiciel système optique Chaque PCR contenait un U de Phusion polymérase Finnzyme OY en tampon Phusion haute fidélité, avec une concentration finale de μM de chaque désoxyribonucléotide triphosphates et mM MgCl Les amorces utilisées pour la détection du gène eaeA étaient ‘-ATGCTTAGTGCTGGTTTAGG-‘ et inverses ‘-GCCTTCATCATTTCGCTTTC-‘ , et elles ont été utilisées à des concentrations finales de μM SYBR Green I Cambrex Bio Science était dilué selon les recommandations du fabricant et mélangé avec de la fluorescéine nM Le démarrage à chaud de ° C pendant quelques secondes a été utilisé pour éviter une amplification non spécifique. Le protocole d’amplification consistait en une incubation à ° C pendant quelques secondes, ° C pendant secondes, ° C pendant secondes et ° C pendant quelques secondes Après les cycles, une courbe de fusion utilisant SYBR Green a été déterminée avec une vitesse de rampe de ° C par seconde à ° C- ° C, avec une lecture tous les ° C. calculé par le logiciel Opticon Monitor, qui a tracé la dérivée négative de la fluorescence par rapport à la température -dF / dT vs T Pour s’assurer que nous n’avions pas d’inhibition de l’amplification à cause de la présence de contaminants dans les échantillons de selles, nous avons des échantillons de selles provenant d’enfants, mélangés avec de l’ADN humain, et déterminé la présence du gène rétroviral endogène ERV comme témoin interne Nous avons obtenu des résultats ERV positifs pour tous les échantillons, y compris ceux négatifs pour le gène eaeA

Efficacité d’amplification et quantification de la charge bactérienne

Nous avons construit des courbes standards en utilisant des quantités connues d’ADN génomique x à x fg extraites d’EPEC E / samples Pour les analyses de courbe standard, les cycles de seuil CT ont été tracés par rapport au log correspondant de la quantité d’entrée ADN déterminant la limite de détection du test. de l’efficacité d’amplification PCR et des sensibilités de détection entre les expériences, les courbes des courbes standards ont été calculées par une analyse de régression linéaire avec le logiciel iCycler Bio-Rad L’efficacité d’amplification a été estimée en utilisant la pente de la courbe étalon. Une réaction avec% d’efficacité générera une pente de – La quantité d’ADN a été calculée comme des copies du gène eaeA par milligramme de selles. De la quantification de l’ADN matrice, une estimation de la charge bactérienne relative dans les différents échantillons a été réalisée. interprétation, nous avons exprimé la charge bactérienne comme des bactéries par milligramme de selles au lieu de génome flic ies par milligramme

Analyses statistiques

Pour estimer la charge bactérienne, une charge bactérienne indétectable dans une PCR isolée positive était considérée comme une bactérie / mg Pour déterminer les différences de charge bactérienne entre les échantillons de diarrhée et de contrôle, les groupes ont été comparés en utilisant un test de Mann-Whitney U modèles de régression logistique ajustés avec interception aléatoire pour évaluer si la charge bactérienne est associée à la diarrhée chez les enfants atteints d’EPEC dans le cadre d’une coinfection ou d’une seule infection Nous avons testé les modèles des effets des facteurs de confusion potentiels tels que l’âge, le sexe, l’allaitement, et alimentation complémentaire Seules les variables restées significatives au niveau ont été retenues dans le modèle final Nous avons utilisé le logiciel Stata, version StataCorp, pour l’analyse

Aspects éthiques

L’étude a été approuvée par les comités d’examen institutionnel de l’Université Peruana Cayetano Heredia et de l’Instituto de Investigación Nutricional, Lima, Pérou

RÉSULTATS

Courbes standard, limites de détection et efficacité d’amplification

Pour démontrer la gamme de détection de la qRT-PCR, des dilutions en série multipliées par X contenant x × fg d’ADN génomique ont été testées en triple pour le gène eaeA de la souche EPEC E / strain. Figure B La limite de détection de cette méthode de la courbe standard de dosage par PCR était des copies du gène eaeA / mg de selles équivalentes à des bactéries / mg selles L’analyse de la courbe de fusion de la qRT-PCR Le produit eaeA est représenté sur la figure C La température de fusion moyenne SD pour le gène eaeA était de ° C ° C L’électrophorèse effectuée pour les produits de PCR montrait une bande spécifique unique de pb correspondant au gène eaeA. Figure D

Figure Vue largeDimension en temps réel de la réaction en chaîne par polymérase RT-PCR pour l’Escherichia coli entéropathogène EPEC A, RT-PCR résultats d’expériences représentatives utilisant l’ADN d’une culture pure de EPEC E / Fluorescence des produits PCR est tracée par rapport au nombre correspondant de copies du gène eaeA de l’intimine, correspondant aux bacilles, pour obtenir le cycle seuil CT B, courbe standard pour l’analyse RT-PCR a été faite à partir du même stock d’ADN dilué -fold Nous avons tracée CT contre le log du nombre de copies eaeA ; l’efficacité de la réaction était>% C, La température de fusion pour le gène eaeA était de ± ° C; des courbes sont superposées pour les différentes concentrations d’ADN utilisées dans l’analyse D,% de gel d’agarose: – des produits de PCR pb correspondant aux dilutions -plus aux bacilles; C, aucun contrôle de modèle; Échelle de poids moléculaire M-bpFigure View largeTaille de téléchargementRéaction en chaîne par polymérase en temps réel quantitative RT-PCR standard pour Escherichia coli entéropathogène EPEC A, RT-PCR résultats d’expériences représentatives utilisant l’ADN d’une culture pure EPEC E / Fluorescence des produits PCR est tracée contre le nombre correspondant de copies du gène eaeA d’intimine, correspondant aux bacilles, pour obtenir le cycle seuil CT B, la courbe standard pour l’analyse RT-PCR a été faite à partir du même stock d’ADN dilué -fold Nous avons tracée CT contre le log de le nombre de copies d’eaeA; l’efficacité de la réaction était>% C, La température de fusion pour le gène eaeA était de ± ° C; des courbes sont superposées pour les différentes concentrations d’ADN utilisées dans l’analyse D,% de gel d’agarose: – des produits de PCR pb correspondant aux dilutions -plus aux bacilles; C, aucun contrôle de modèle; Échelle de poids moléculaire M-bp

Quantification de l’EPEC dans les échantillons de selles

La charge EPEC dans les échantillons de selles provenant d’enfants infectés ou colonisés avec une colonie préalablement isolée positive par PCR variait de ≤ bactéries / mg à × bactéries / mg Les données quantitatives montrant la charge EPEC chez les enfants diarrhéiques et en bonne santé sont montrées dans la Figure Figure A Nous avons trouvé des échantillons avec une charge de bactéries fécales ≤ bactéries / mg, dont% provenait d’échantillons de nourrissons sains. Parce que la plupart des rapports sur E coli diarrhéique montrent des différences de taux d’incidence selon l’âge. , nous avons divisé les échantillons en fonction des groupes d’âge Figure B Parmi les enfants & lt; mois, la charge bactérienne dans le groupe diarrhéique était significativement plus élevée que dans le groupe témoin P =; il n’y avait pas de différences statistiquement significatives chez les enfants plus âgés. Les co-infections étaient courantes, représentant% des échantillons diarrhéiques et% des échantillons témoins; Il n’y avait pas de différence statistiquement significative dans la charge EPEC entre la diarrhée et les groupes témoins lorsqu’ils étaient présents dans une infection mixte Figure C Il n’y avait pas de différence dans la distribution par âge entre les groupes pathogènes uniques et les groupes de co-infection. et EPEC avec E coli entérotoxigène n = Cependant, parmi les échantillons de selles avec EPEC comme pathogène unique, la charge bactérienne était significativement plus élevée dans la diarrhée que dans les échantillons témoins vs bactéries / mg; P =; Figure C Fait intéressant, nous n’avons pas trouvé de différences dans le nombre moyen de colonies positives EPEC par patient colonies ont été recueillies par patient de la plaque MacConkey de la PCR initiale entre la diarrhée et les échantillons témoins De même, il n’y avait pas de corrélation entre le nombre de colonies positives par patient de la PCR initiale de la plaque MacConkey et la charge bactérienne déterminée directement à partir des échantillons de selles

Tableau Escherichia coli entéropathogène Charge dans les échantillons de selles des enfants souffrant de diarrhée et sans contrôle de la diarrhée, mesurée par la réaction en chaîne de la polymérase quantitative en temps réel Diarrhée Moyenne géométrique% CI bactéries / mg Moyenne géométrique témoin% CI bactéries / mg valeur P Tous les échantillons de selles – – n = N = Par groupe d’âge & lt; mois – – n = n = ≥ mois – – n = n = Par type d’infection EPEC Sole pathogène isolé – – n = n = Coïnfection – – n = n = Diarrhée Moyenne géométrique% CI bactéries / mg Moyenne géométrique de contrôle% CI bactéries / mg P valeur Tous les échantillons de selles – – n = n = par groupe d’âge & lt; mois – – n = n = ≥ mois – – n = n = Par type d’infection EPEC Seul pathogène isolé – – n = n = Coïnfection – – n = n = Abréviations: IC, intervalle de confiance; EPEC, Escherichia coliView entéropathogène Large

Figure View largeTélécharger la lameComparaison de Escherichia coli entéropathogène charge EPEC parmi les échantillons de diarrhée et témoin A, Diarrhée échantillons barres grises et échantillons de sujets témoins sains barres blanches EPEC charge dans les échantillons de selles des enfants avec n = et sans n = diarrhée; * P = B, charge EPEC chez les enfants & lt; mois de diarrhée, n =; contrôle, n = et enfants – mois de diarrhée, n =; contrôle, n =; ** P = C, charge EPEC dans la diarrhée coïnfection, n =; témoin, n = et diarrhée d’infection à un seul agent pathogène, n =; contrôle, n =; *** P = Figure View largeTélécharger slide Comparaison de Escherichia coli entéropathogène charge EPEC parmi les échantillons de diarrhée et de contrôle A, échantillons de diarrhée barres grises et échantillons de sujets témoins sains barres blanches EPEC charge dans les échantillons de selles des enfants avec n = et sans n = diarrhée; * P = B, charge EPEC chez les enfants & lt; mois de diarrhée, n =; contrôle, n = et enfants – mois de diarrhée, n =; contrôle, n =; ** P = C, charge EPEC dans la diarrhée coïnfection, n =; témoin, n = et diarrhée d’infection à un seul agent pathogène, n =; contrôle, n =; *** P =

Charge EPEC et données cliniques

Parmi les cas de diarrhée, des échantillons de selles ont été recueillis sur un nombre variable de jours de maladie. Dans l’ensemble, il y avait une tendance à une charge bactérienne plus élevée durant les premiers jours de la maladie. % correspondant à un épisode léger,% à un épisode modéré, et% à un épisode sévère La charge bactérienne était similaire entre les cas légers et modérés vs les bactéries / mg; P = La durée de la diarrhée était connue dans les épisodes; la durée moyenne SD était les jours médians, jours; gamme, – jours Vingt-huit épisodes ont duré & lt; jours, a duré – jours, et a duré & gt; jours Nous n’avons trouvé aucune différence dans la charge bactérienne par rapport à la durée de l’épisode vs vs bactéries / mg pour & lt ;, -, et & gt; Nous avons également exploré la charge bactérienne liée à l’allaitement de l’enfant au moment de la collecte des échantillons. Quatre-vingt-seize enfants étaient allaités et avaient des diarrhées et des contrôles, alors qu’ils n’étaient pas diarrhéiques ni témoins Chez les enfants allaités, il n’y avait pas de différence statistiquement significative. charge bactérienne des échantillons diarrhéiques et témoins vs bactéries / mg; P = Parmi les enfants qui n’allaitaient pas au moment de l’échantillonnage, une charge bactérienne significativement plus élevée a été trouvée dans les échantillons de diarrhée que dans les échantillons témoins sains par rapport aux bactéries / mg, respectivement; P =

Tableau Escherichia coli entéropathogène Charge par rapport au jour de la maladie Jour de la maladie Non% des échantillonsa Moyenne géométrique% CI bactérie / mg – – – – – ≥ – Jour de la maladie Non% des échantillonsa Moyenne géométrique% CI bactéries / mg – – – – – ≥ – Abréviation: IC, intervalle de confianceaForty-six échantillons ont été inclus; échantillons ont été exclus car il n’y avait pas de date d’enregistrement du début de l’épisode

Association entre la charge bactérienne et la diarrhée

Les coefficients de la régression logistique avec effets aléatoires pour les enfants atteints d’EPEC dans le cadre d’une co-infection ou d’une seule infection ont été déterminés après ajustement pour l’âge, le sexe et une interaction des deux. ratio, % CI, – pour chaque unité logarithmique, augmentation de la charge bactérienne dans l’échantillon de selles

DISCUSSION

Par conséquent, nous proposons que, en plus des facteurs susmentionnés, la charge bactérienne doit être considérée dans l’interprétation de la maladie et la colonisation des agents pathogènes dans les études épidémiologiques Des pays en développement ont été menés chez des enfants afin de déterminer les différences liées à l’âge dans les infections diarrhéiques à E. coli [, -] Comme dans ces études, nous avons trouvé une relation entre l’âge et les symptômes. La charge bactérienne était supérieure à celle des sujets témoins sains infectés par le même agent pathogène, ce qui correspond à l’opinion généralement acceptée selon laquelle l’EPEC est un véritable agent pathogène chez les jeunes enfants. Il semble y avoir un seuil réduit de charge bactérienne l’initiation de l’infection EPEC chez les nourrissons plus jeunes; cependant, la charge bactérienne chez les patients diarrhéiques semble rester inchangée chez les nourrissons plus jeunes, probablement liée à la présence ou l’absence de facteurs protecteurs. Dans les pays en développement, les infections mixtes sont fréquentes, en particulier dans les échantillons diarrhéiques. est responsable des symptômes Dans cette étude, parmi les infections mixtes, nous avons trouvé une charge EPEC similaire chez les enfants avec et sans diarrhée, ce qui suggère que l’EPEC peut ne pas avoir eu de rôle dans ces épisodes de diarrhée. infection par des agents pathogènes, nous avons trouvé une forte association entre l’EPEC et la diarrhée, démontrée par la charge bactérienne plus élevée chez les enfants diarrhéiques que chez les témoins sains. Ceci suggère que l’EPEC est un véritable agent pathogène lorsqu’il est isolé; Cependant, dans l’infection mixte, nous supposons que des charges EPEC plus élevées seraient nécessaires pour surmonter une infection mixte. De même, chez les enfants allaitant au moment de la collecte des échantillons, il n’y avait aucune différence dans la charge bactérienne dans les échantillons diarrhéiques et témoins. Nous constatons que le lait maternel protège ces enfants contre les infections symptomatiques Inversement, le lait maternel peut avoir réduit la charge mais pas totalement empêché les symptômes liés à l’EPEC chez ces enfants. D’autres études seront nécessaires pour confirmer chacune de ces importantes conclusions. Avec la mise en place d’outils moléculaires, la limite de détection des agents pathogènes s’est améliorée et la quantification est désormais possible Dans cette étude, nous avons développé, standardisé et validé une qRT-PCR pour EPEC dans les échantillons de selles L’approche rapportée ici n’est pas entièrement nouvelle Des tests de RT-PCR ont été développés dans le passé pour la détection n et quantification des entéropathogènes dans les échantillons alimentaires, animaux et cliniques , y compris les dosages de Campylobacter, Cryptosporidium, Salmonella, E. coli O: H et d’autres E coli producteurs de Shigatoxines Dans l’ensemble, la méthode d’isolement de l’ADN la plus courante L’étude actuelle propose l’application d’une méthode d’extraction au bromure comme méthode alternative d’isolation de l’ADN, moins chère que les kits commerciaux. Il convient de noter que cette étude est, à notre connaissance, la première étude qui applique une analyse qRT-PCR pour EPEC dans des échantillons humains et compare des échantillons de selles d’enfants avec et sans diarrhéeCette étude a quelques limites. Premièrement, nous n’avons pas recherché tous les pathogènes entériques norovirus, astrovirus, adénovirus entérique, Yersinia et parasites pour définir l’infection à un seul agent pathogène avec EPEC Cela pourrait expliquer un certain chevauchement dans les groupes de patients avec seulement une infection EPEC trouvé, parce que dans certains cas, des infections mixtes non reconnues pourraient avoir été présentes. Cependant, nous avons évalué des échantillons de selles pour les pathogènes les plus communs chez les enfants rotavirus, tous les E coli diarrhéiques, Shigella, Salmonella et Campylobacter. Troisièmement, le nombre d’échantillons diarrhéiques n’était pas suffisant pour déterminer de façon optimale la relation entre la charge bactérienne et la durée de la maladie et la sévérité de la diarrhée ou de la diarrhée. Effet de l’allaitement et de l’âge sur la charge bactérienne Des études futures sont nécessaires avec un plus grand nombre d’échantillons diarrhéiques EPEC pour clarifier ces questions importantes. En résumé, nous avons développé, standardisé et validé une qRT-PCR pour EPEC dans des échantillons de selles avec un bromure d’ADN peu coûteux. méthode d’extraction qui peut être utilisée comme un outil de diagnostic pour clarifier les différences entre les deux points Nous avons constaté que la charge bactérienne de l’EPEC, mesurée par qRT-PCR des échantillons de selles, est plus élevée chez les enfants atteints de diarrhée que chez les sujets témoins en bonne santé.

Remarques

Aide financière

Ce travail a été soutenu par un prix du service de santé publique subventions KTW à T J O et R-HD à T G C de la National Institutes of Health; par l’Agence espagnole de coopération internationale pour le développement, Espagne D // et D // de J R et T J O; et par les fonds de recherche institutionnelle du Dr Lanata

Conflits d’intérêts potentiels

Tous les auteurs: Aucun conflit signalé Tous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits d’intérêts potentiels Conflits que les éditeurs considèrent pertinents pour le contenu du manuscrit ont été divulgués