Colonisation microbienne du tractus gastro-intestinal supérieur chez les patients présentant un œsophage de Barrett

Contexte L’œsophage de Barrett BE est une complication du reflux gastro-œsophagien chronique, qui augmente considérablement le risque de dysplasie oesophagienne et d’adénocarcinome au cours des dernières décennies. L’incidence de l’EH et de l’adénocarcinome a augmenté; Le but de cette étude était de caractériser les communautés microbiennes dans les échantillons d’aspiration oesophagienne et sur les échantillons distaux de muqueuse oesophagienne des patients avec BEMethods. Les biopsies et les échantillons d’aspiration ont été obtenus par examen endoscopique chez des patients avec BE et des sujets témoins Les isolats bactériens ont été identifiés par séquençage du gène de l’ARN ribosomique S L’examen microscopique par fluorescence a également été utilisé pour déterminer la localisation spatiale de ces organismes sur les surfaces muqueuses. Colonisation importante a été détectée chez des patients avec BE et chez des sujets témoins. Résultats Globalement, des espèces bactériennes appartenant à des genres ont été détectées, avec des espèces communes dans les deux groupes. Les échantillons d’aspiration et de biopsie des patients avec BE contenaient des populations complexes de bactéries. Des souches de Campylobacter Campylobacter concisus et Campylobacter rectus, liées à l’entérite, aux infections parodontales et à la formation de tumeurs chez les animaux, ont été trouvées chez% des patients avec BE mais chez aucun des sujets témoins. L’examen microscopique a révélé que les bactéries sur les biofilms muqueux L’occurrence d’espèces de Campylobacter réduisant les nitrates chez les patients atteints d’EH peut suggérer qu’il y a un lien dans l’initiation, le maintien ou l’exacerbation des processus pathologiques menant à la formation d’adénocarcinome.

L’œsophage de Barrett BE est une complication du reflux gastro-oesophagien chronique, dans lequel les cellules épithéliales squameuses qui tapissent l’œsophage distal subissent des modifications métaplasiques, formant une muqueuse cylindrique Les patients avec BE ont un risque accru de dysplasie œsophagienne et d’adénocarcinome % des patients avec reflux gastro-œsophagien développent BE , et ceux avec BE développent un adénocarcinome œsophagien à raison de ~ cas par patient-années Les taux de carcinome de l’estomac moyen et distal diminuent; inversement, l’adénocarcinome de l’œsophage a augmenté régulièrement dans les pays occidentaux au cours des dernières décennies , et il est maintenant la septième cause la plus fréquente de décès liés au cancer au Royaume-Uni. et bien que tous les cas d’adénocarcinome soient observés chez les patients avec BE, seuls les patients avec adénocarcinome reçoivent un diagnostic antérieur de BE Le traitement de l’adénocarcinome de l’œsophage échoue généralement, avec des taux de survie annuels aussi bas que% Thérapie agressive Le rôle des micro-organismes dans le BE est incertain Le tractus gastro-intestinal supérieur, en raison de la motilité intestinale et de la sécrétion d’acide, n’est habituellement que faiblement colonisé par les bactéries et les bactéries. levures Le nombre de cellules bactériennes viables dans l’estomac est habituellement & lt; cellules / mL, avec Helicobacter pylori et des espèces gram-positives aciduriques, telles que les lactobacilles et les streptocoques, prédominant généralement Inhibiteurs de la pompe à protons Les IPP sont utilisés pour traiter les patients atteints de reflux gastro-œsophagien; Cependant, cette méthode de traitement peut entraîner une prolifération microbienne en raison de la réduction de l’acide gastrique et peut entraîner des dommages épithéliaux en raison de la production de nitrosamines et d’autres carcinogènes par les bactéries Hpylori a été démontré de manière concluante pour causer l’ulcère duodénal et le cancer gastrique par des mécanismes indirects en raison de la colonisation chronique de la muqueuse gastrique superficielle Cette bactérie a été étudiée par rapport à BE, avec des études initiales indiquant qu’elle pourrait avoir un rôle protecteur Compte tenu du rôle de H pylori dans la A notre connaissance, il n’y a eu que des études préliminaires sur les bactéries associées à la muqueuse œsophagienne chez les patients atteints d’EH. Dans la première étude , il a été rapporté que la colonisation microbienne accrue, principalement par des cocci à Gram positif, survenus lors d’une analyse rétrospective de tissus œsophagiens Dans la seconde étude, une approche de clonage non quantitative a été utilisée pour identifier les bactéries sur un échantillon muqueux provenant d’un patient atteint de BE et d’espèces bactériennes détectées, dont ~% étaient des sujets sains. En raison de leur proximité avec les tissus de l’hôte, les bactéries des muqueuses sont plus susceptibles que les populations transitoires d’interagir avec l’épithélium œsophagien. Pour déterminer si les bactéries des muqueuses jouent un rôle dans l’EB, Il est important de déterminer si les microorganismes forment des communautés muqueuses distinctes sur la surface épithéliale ou sont simplement des transitoires résultant du transfert passif des aspirats. De nombreuses méthodes sont utilisées pour étudier la colonisation bactérienne, des techniques culturales traditionnelles en utilisant le placage sélectif aux méthodes moléculaires telles que la fluorescence. hybridation in situ , électrophorèse sur gel à gradient dénaturant s , PCR en temps réel , et analyse des banques de clones L’avantage des techniques de culture est que les organismes viables présents dans les échantillons d’aspiration ou sur les muqueuses peuvent être quantifiés et utilisés pour des travaux ultérieurs.Le but de cette étude était de caractériser les microaérophiles. , et des microorganismes anaérobies dans les échantillons d’aspiration oesophagienne et sur les surfaces muqueuses dans l’œsophage distal des patients avec BE et pour comparer ces communautés avec celles des sujets témoins qui ont des muqueuses œsophagiennes normales

Patients et méthodes

Patients Des biopsies œsophagiennes et des prélèvements par aspiration ont été réalisés chez des individus femelles et mâles âgés de – ans; âge moyen, années d’hospitalisation à la clinique externe de gastroentérologie de l’hôpital Ninewells Dundee, Royaume-Uni Sept sujets avaient un BE et les patients de la clinique présentant des symptômes gastro-intestinaux supérieurs nécessitant un examen endoscopique ont été utilisés comme sujets témoins par examen endoscopique et histologique. Aucun signe d’ostéoporose Les caractéristiques des patients sont indiquées dans le tableau Aucun des sujets n’avait reçu d’antibiotiques dans les semaines précédant l’enquête Le consentement éclairé du patient a été obtenu auprès du Comité de Tayside sur l’éthique de la recherche médicale Dundee, Royaume-Uni.

Caractéristiques de patients dans une étude de colonisation microbienne du tractus gastro-intestinal supérieurEnumération et identification de bactéries dans des échantillons d’aspiration et de biopsie muqueuseLes échantillons de biopsie et d’aspiration oesophagienne ont été transférés dans des bouteilles stériles de Bijoux contenant des mL de transport anaérobie. Les mesures de pH du bouillon Wilkins-Chalgren ont été obtenues à partir d’une partie de chaque échantillon d’aspiration. Les dimensions des échantillons de biopsie ont été déterminées à l’aide d’un micromètre, après avoir placé les échantillons dans une chambre anaérobie à ° C atmosphère: N,%; CO,%; Les échantillons de biopsie ont été lavés doucement dans le milieu de transport, placés dans des mL de milieu de transport frais, et dispersés à l’aide d’un homogénéisateur de tissu de verre stérile. Un millilitre d’homogénat de biopsie du La biopsie ou l’échantillon d’aspiration a été dilué dans des tubes à essai contenant des mL d’eau peptone anaérobie à demi-résistance. Cinquante microlitres de l’échantillon original et μL de toutes les dilutions diluées ont été étalés en triple sur des milieux de culture solides sélectifs et non sélectifs. Les anaérobies ont été isolés à l’aide de gélose nutritive pour aérobies totaux et anaérobies facultatifs, de gélose au sang azoté pour cocci Gram positif et de gélose MacConkey pour bactéries entérobactéries. Des anaérobies ont été isolées à l’aide de gélose Wilkins-Chalgren avec% de sang de cheval ajouté pour anaérobies totaux, gélose Wilkins-Chalgren avec gramme -négatif des suppléments anaérobies pour les anaérobies gram-négatives, Agar Clostridial renforcé pour clostridia, Azide Agar au sang pour les cocci anaérobies, et agar Rogosa pour les lactobacilles Les bifidobactéries ont été dénombrées en utilisant l’agar de Beerens Le groupe Bacteroides fragilis a été dénombré en utilisant Bacteroides Mineral Salts agar Les plaques aérobies ont été incubées à ° C pendant h et les plaques anaérobies incubées à ° C. pendant des jours, des plaques de gélose Columbia additionnées de% de sang de cheval, additionnées d’espèces Campylobacter ou de suppléments sélectifs d’espèces Helicobacter, ont été utilisées pour l’isolement sélectif des espèces Campylobacter ou H pylori, et des plaques de gélose au chocolat ont été utilisées pour isoler d’autres microorganismes exigeants. Don Whitley Scientific Levure et moule ont été utilisés pour l’isolement sélectif des levures identifié par l’analyse de la séquence du gène S rRNA, et les levures ont été identifiées usi L’ADN bioMérieux ADN a été isolé à l’aide d’une méthode modifiée basée sur le Qiagen DNA Qiagen Qiagen, comme décrit précédemment amplification par PCR et analyse de séquence du gène S rRNA L’ADN purifié a été dilué, et μL de la dilution a été utilisé comme matrice dans un mélange réactionnel contenant nmol / L d’amorces eubactériennes , mmol / L de MgCl, mmol / L de Tris-HCL pH, mmol / L de KCL,% de Triton X-, ADN polymérase Promega U de Taq, et μmol / L de chaque dNTP Bioline dans un volume total de μL Les réactions de PCR ont été dénaturées à ° C pendant min, suivies de cycles à ° C pour min, ° C pour la phase de recuit min, et ° Les produits de PCR Techne ont été résolus par électrophorèse sur gel d’agarose% contenant μg / mL de bromure d’éthidium. Le séquençage a été effectué en utilisant un séquençage du terminateur Big Dye sur un ABI. Analyse génétique Les recherches de l’outil de recherche d’alignement local de base d’Applied Biosystems ont été effectuées pour chaque paire de bases de séquences compilées par rapport à celles du National Center for Biotechnology. visualisé, comme décrit précédemment Sondes oligonucléotidiques Les sondes oligonucléotidiques S ARNr utilisées dans l’étude ont été décrites et validées précédemment Probe Str -GTTAGCCGTCCCTTTCTGG- a été utilisée pour identifier les streptocoques , et Camp -CTGCCTCTCCCTYACTCT- a été utilisée pour identifier les espèces Campylobacter Les sondes ont été synthétisées par Thermohybaid Interactiva Division, et ont été marquées avec FITC ou hybridation in vitro cyFluorescente antiseptique. L’hybridation pour les deux sondes a été réalisée à ° C dans une chambre humide pour h, comme décrit précédemment. Analyse statistique L’analyse des données a été réalisée avec GraphPad Prism , version GraphPad Software Logarithmes de m les nombres microbiens ont été utilisés pour obtenir une distribution normale, et les données sur les groupes de patients avec et sans BE ont été comparées en utilisant le test t de l’échantillon indépendant P & lt; A moins d’indication contraire, tous les milieux de culture bactérienne et les suppléments ont été obtenus auprès d’Oxoid. D’autres produits chimiques ont été achetés auprès de Sigma.

Résultats

Mesures de bactéries et de levures Une gamme variée de bâtonnets et de cocci microaérophiles, anaérobies facultatifs anaérobies et anaérobies Gram positif et Cocci ont été détectés comme colonisateurs dans les muqueuses oesophagiennes et aspirés chez les sujets témoins et les patients atteints de microbiotas BE Aspirate ont été détectés chez des patients BE et chez les sujets témoins La colonisation muqueuse a été observée chez des patients avec BE et chez des sujets témoins. Le nombre total de bactéries et de levures dans les échantillons d’aspiration chez les patients avec BE était plus élevé que chez les sujets témoins, mais la différence n’était pas statistiquement significative. des bactéries et des levures dans les échantillons muqueux des patients avec BE étaient similaires à celles dans les échantillons muqueux des sujets témoins Les IPP étaient utilisés pour traiter tous les patients avec BE Quatre personnes avec des œsophages sains ne recevaient pas d’IPP et de ces personnes étaient colonisées par des bactéries Le pH des échantillons prélevés chez des patients atteints de BE variait de par le pH moyen [± SD], ±, et le pH des échantillons d’aspiration des sujets témoins variait du pH moyen [± SD], les bactéries ± Viable n’ont été détectées dans aucun échantillon de patient lorsque le pH des échantillons d’aspiration était & lt ;, où Seules les levures ont été trouvées. Les tableaux montrent que les matériaux d’aspiration et de biopsie contenaient des populations bactériennes complexes, avec une plus grande diversité d’espèces chez les patients avec BE. Quarante-six espèces bactériennes appartenant à des genres ont été trouvées. isolé chez des patients avec BE, avec des espèces communes dans les deux groupes H pylori n’a été détecté chez aucun des patients

Figure Vue largeTélécharger le nombre total de bactéries et de levures isolées des échantillons d’aspiration et des échantillons de muqueuse œsophagienne des sujets témoins et des patients atteints d’œsophage de Barrett BE Les valeurs au-dessus des barres représentent le nombre de sujets détectés. des barres et des lignes au-dessus des barresFigure numéro largeTélécharger le nombre total de bactéries et de levures isolées des échantillons d’aspiration et des échantillons de muqueuse œsophagienne des sujets témoins et des patients atteints d’œsophage de Barrett BE Les valeurs au-dessus des barres représentent le nombre de sujets détectés. les nombres et les SD sont représentés comme le sommet des barres et les lignes au-dessus des barres

Tableau View largeTélécharger slideTiges de Gram positif isolées à partir d’un matériau d’aspiration et de biopsie oesophagienneTable View largeTélécharger une lameTiges de Gram positif isolées à partir d’un matériau d’aspiration et de biopsie oesophagienne

Les bactéries et les levures chez les sujets témoins Les lactobacilles, les streptocoques et les levures étaient les seuls genres détectés dans les échantillons prélevés chez des patients sans tableaux BE et levures, En revanche, seuls les isolats de Lactobacillus ont été obtenus – avec un plus grand nombre de streptocoques – provenant du tissu muqueux des sujets témoins. Aucune levure n’a été détectée sur les échantillons de muqueuse. ; cependant, une gamme d’autres bactéries, telles que actinomyces et prevotella, ont été trouvés qui n’étaient pas présents dans les tables d’échantillons d’aspiration et

Table View largeTélécharger slideCocci Gram positif isolé à partir d’un matériau d’aspiration et de biopsie œsophagienneTable Voir grandTutoriel de téléchargementCocci Gram positif isolé à partir d’un matériau d’aspiration et de biopsie oesophagienne

Tableau View largeTélécharger slideGram-bactéries négatives isolées du tissu de l’aspiration et de l’œsophageTable View largeTélécharger slideGram-bactéries négatives isolées du tissu de l’aspiration et de l’œsophageBactéries et levures chez les patients atteints de BE Une variété de bactéries ont été trouvées dans les échantillons d’aspiration et de muqueuse des patients atteints de lactobacilles BE ont été détectés en grand nombre dans des échantillons d’aspiration et de muqueuse provenant de patients avec BE table Prevotellas ont été trouvés seulement dans les échantillons de la muqueuse Les levures étaient présentes en faible nombre dans les échantillons d’aspiration et dans les échantillons de la muqueuse. l’échantillon muqueux du patient Des isolats isolés de mégasphaera, gemella, selenomonas, rothia et entérobactéries ont également été trouvés dans les échantillons d’aspiration des patients avec BECpar comparaison des populations aspirées et muqueuses. genres et spe On a trouvé plus d’espèces et un nombre accru de streptocoques dans les échantillons prélevés chez des patients avec BE. Des levures étaient présentes dans les échantillons d’aspiration des deux groupes de patients. Bien que le nombre de levures était plus élevé chez les témoins, on a trouvé des différences dans les échantillons de muqueuse œsophagienne chez des sujets sans genres et espèces BE, comparativement à des échantillons muqueux chez des patients de genres et espèces BE, avec des espèces trouvées dans les échantillons des deux groupes. Inversement, les levures, les fusobactéries, les mégasphaires, les neisseria et les espèces de Camplylobacter ont été isolées chez des patients atteints de BE. Les précotellas ont été détectés uniquement dans des échantillons de muqueuse dans les deux groupes de patients, et des cocci à Gram négatif ont été détectés dans les muqueuses. tissu muqueux du sujet témoin et en aspiration et m Des échantillons de patients atteints de BECampylobacterspecies ont été observés seuls des niveaux élevés d’espèces Campylobacter colonisaient% des patients avec BE, mais aucun des sujets témoins n’a été colonisé par ces organismes. Campylobacter rectus et Campylobacter concisus ont été trouvés dans des échantillons d’aspiration de patients. avec BE et dans des échantillons de muqueuse œsophagienne provenant de patients atteints de la table BE Les espèces Campylobacter ont été isolées sur gélose Wilkins-Chalgren avec des suppléments anaérobies Gram négatif et incubées anaérobiquement à ° C. Chez les patients atteints de BE, C concisus était le pathogène le plus prévalent. les nombres C rectus ont été trouvés seulement dans les échantillons de muqueuse

Tableau View largeTélécharger slideCampylobacter espèces isolées de l’œsophage et de la biopsie de patients atteints d’œsophage de BarrettTable View largeTélécharger diapositiveCampylobacter espèces isolées de l’œsophage et de la biopsie de patients atteints d’œsophage de BarrettMicroscopic studies On a souvent observé des bactéries muqueuses dans les microcolonies et les agrégats cellulaires, avec muqueuse Dans la figure A, on peut voir une microcolonie bactérienne composée principalement de cocci sur l’échantillon muqueux, tandis que sur la figure B, on voit un mélange hétérogène de différentes bactéries se répandre sur la couche de mucus. on peut voir un grand nombre de streptocoques recouvrant la surface de la muqueuse, et la figure D montre la colonisation par une espèce de Campylobacter d’un échantillon de muqueuse provenant de patients atteints de BE.

Figure Vue largeTélécharger les lamesA et B, sections confocales des échantillons de biopsie muqueuse colorés pour la viabilité cellulaire, contenant des mélanges d’organismes vivants jaunes et rouges morts Microcolonie et formation d’agrégats peuvent être observés dans les échantillons muqueux des sujets témoins A et des patients atteints d’œsophage de Barrett BC et D , Micrographies en lumière par fluorescence des coupes transversales des muqueuses oesophagiennes de Barrett montrant une colonisation par streptocoques C et Campylobacter espèces D, utilisant des sondes oligonucléotidiques ARN S ribosomales marquées au FITC et cy A, B et D, Grossissement original × C, Grossissement original × Figure View largeTélécharger slideA et B, coupes confocales d’échantillons de biopsies muqueuses colorées pour la viabilité cellulaire, contenant des mélanges d’organismes vivants jaunes et rouges morts Microcolonie et formation d’agrégats visibles dans les échantillons muqueux des sujets témoins A et des patients avec œsophage de Barrett BC et D, lumière fluorescente micrographies de sections transversales de Barrett’s eso muqueuse phagique montrant une colonisation par des streptocoques C et des espèces de Campylobacter D, utilisant des sondes oligonucléotidiques d’ARN ribosomique S marquées avec FITC et cy A, B et D, Grossissement original × C, Grossissement original ×

Discussion

véritable colonisation muqueuse par ces micro-organismes et non seulement simple, la contamination Aspirer la colonisation bactérienne de l’intestin supérieur n’a pas été entièrement dépendant de l’utilisation des IPP chez les patients avec BE, car une vaste croissance bactérienne a également eu lieu chez des sujets témoins ne recevant PPIsAlthough l’épithélium doublé colonnaire Chez les patients atteints de BE, l’épithélium gastrique peut être colonisé par H pylori , cet organisme n’a pas été détecté dans notre étude. À notre connaissance, seules des études antérieures ont étudié le microbiote chez des patients atteints d’EI. visualisée immédiatement ou stockée dans un fixateur pour prévenir les dommages aux bactéries et préserver l’architecture tissulaire. Dans l’étude d’Osias et al , la coloration de Gram a été réalisée rétrospectivement sur des échantillons tissulaires stockés, et bien qu’un grand nombre de cocci Gram positif aient été détectés. les échantillons muqueux des patients avec BE, cela n’a pas pris en compte les pertes de cellules potentielles au cours de la réparation En outre, dans notre étude, de nombreuses bactéries de la muqueuse existaient dans les microcolonies et les agrégats et ne pouvaient donc pas être quantifiées avec précision par un examen microscopique in situ. Dans l’étude précédente , des spécimens de biopsie étaient cultivés. La seconde étude de Pei et al a permis de réaliser une culture aérobie sans identification des isolats. Une analyse de clonage en profondeur a été réalisée Compte tenu de notre étude, actinomyces, cocci à Gram positif, C concisus et C rectus n’ont pas été détectés chez les patients avec BE. Dans notre étude, peu de différences cohérentes ont été observées en ce qui concerne la contamination par aspiration. à la structure de la communauté bactérienne œsophagienne Une exception significative était la présence d’espèces pathogènes de Campylobacter réduisant les nitrates chez les patients Ces bactéries n’ont probablement pas été détectées auparavant parce qu’elles sont des microaérophiles à croissance lente et fastidieuse qui nécessitent généralement des techniques de filtration spéciales Elles ont également besoin d’une atmosphère enrichie en hydrogène et sont inhibées par de nombreux antibiotiques dans des milieux de culture sélectifs utilisé pour l’isolement d’autres espèces de Campylobacter, comme Campylobacter jejuni et Campylobacter coli C concisus a été associée à des maladies parodontales chez l’homme et liés à l’entérite chez les enfants , tout en étant associée à la maladie diarrhéique chez les patients immunodéprimés [ ] Le rectus a été impliqué comme pathogène parodontal et se rencontre plus fréquemment et à des niveaux plus élevés dans les sites malades que dans les sites sains dans la bouche On a spéculé que certains dommages associés à BE sont dus à la réduction des nitrates par les bactéries buccales. cette forme nitrite; dans des conditions acides, la réduction des nitrates peut conduire à la production de composés N-nitroso cancérigènes et d’oxyde nitreux , qui inhibent les enzymes de réparation de l’ADN et peuvent être mutagènes à fortes doses . montré se produire à la jonction gastro-oesophagienne ; Ce résultat confirme la notion d’implication bactérienne dans les événements mutagènes associés au BE. On a également observé une augmentation du nombre de veilloellas réductrices de nitrates chez les patients atteints de BE par rapport aux sujets témoins, et ces organismes ont été signalés les carcinomes épidermoïdes Certaines souches de C. concisus ont été montrées à envahir les cellules Hep plus rapide que C jejuni souches et pour produire un effet cytotoxique analogue sur les cellules d’ovaire de hamster chinois, entraînant la formation intracytoplamic de vacuole, similaire à celle provoquée par H pylori L’examen microscopique par fluorescence a démontré que de nombreux organismes sont présents dans les microcolonies et que des agrégats se sont produits sur les tissus oesophagiens. vivent / coloration morte a montré que la majorité des organismes vivaient La présence d’espèces bactériennes immunogènes et éventuellement génotoxiques dans microcolonies sur l’épithélium oesophagien peut avoir des implications pour être, parce que des concentrations plus élevées localisées d’antigènes bactériens ou des déchets, tels que le nitrite et l’oxyde nitrique Les résultats de notre étude supposent que les espèces de Campylobacter productrices de toxines pathogènes et présumées pourraient être impliquées dans l’initiation, le maintien ou l’exacerbation des processus pathologiques de l’œsophage. Un lien potentiel entre ces organismes et la séquence des événements menant de BE à la formation d’adénocarcinomes est intrigante, parce que tous les patients avec des espèces de port BE Campylobacter ou des études de adénocarcinomes sont maintenant nécessaires pour déterminer comment les espèces de Campylobacter interagissent avec les processus cellulaires et métaboliques sur la muqueuse de l’œsophage et de déterminer si elles sont susceptibles d’être dans l’étiologie de la maladie néoplasique

Remerciements

Soutien financier Tenovus Glasgow, Écosse Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: pas de conflits