Résistance à l’inhibiteur de la neuraminidase après le traitement par l’oseltamivir des grippes aiguës A et B chez les enfants

Contexte L’oseltamivir, un inhibiteur spécifique de la neuraminidase, est un traitement efficace contre la grippe saisonnière L’émergence de virus grippaux pharmacorésistants après traitement a été signalée, en particulier chez les enfants au Japon, où le schéma posologique est différent de celui utilisé dans le reste du monde Méthodes Nous avons analysé des échantillons cliniques nasopharyngés séquentiels, obtenus avant et après un traitement à base d’oseltamivir à base de poids, chez des enfants atteints de grippe aiguë pendant – Nous avons isolé des virus, testés Soixante-quatre enfants atteints du sous-type HN du virus grippal A, du sous-type HN du virus de la grippe A et du virus de la grippe B âgés de plus de dix ans – âge médian – années médianes de détermination de la neuraminidase , années, mois ont été inscrits Par jours – après début de traitement, des échantillons testés,% et% avaient un virus détectable par réaction en chaîne par polymérase-transcriptase inverse et culture, respectivement Par jour – après initiation du traitement, des échantillons testés,% et% avaient un virus détectable par réaction de polymérase-transcriptase inverse Nous avons trouvé aucune différence statistiquement significative dans la réduction de l’excrétion virale ou le délai d’élimination du virus entre les sous-types viraux. Les virus résistants aux antiviraux ont été récupérés chez les enfants atteints du sous-type HN, et% d’enfants infectés par le virus de la grippe B, tous traités par oseltamivir P = Il n’y avait aucune preuve de maladie prolongée chez les enfants infectés par des virus pharmacorésistantsConclusions La résistance aux médicaments émerge plus rapidement dans le sous-type H3 que dans la grippe A sous-type HN ou virus de l’influenza B après une thérapie à base d’oseltamivir à pondération par paliers Surveillance virologique des patrons de résistance aux médicaments est essentielle pour la détermination des stratégies de traitement antiviral et pour la composition des stocks de préparation à la pandémie

Les virus grippaux A et B sont responsables des éclosions saisonnières et, dans le cas du virus de l’influenza A, des pandémies peu fréquentes. M & gt; Les inhibiteurs des canaux ioniques amantadine et rimantadine sont actifs contre le virus grippal A, mais leur utilisation clinique est limitée par l’inactivité au virus B et l’émergence de souches pharmacorésistantes transmissibles Les inhibiteurs de la neuraminidase oseltamivir et zanamivir ont été autorisés pour le traitement et la prévention. Les plans de préparation mettent l’accent sur le traitement précoce des patients , et parce que l’oseltamivir est un agent oral approprié pour le stockage en vrac, la création de Des études cliniques à grande échelle de l’oseltamivir ont rapporté une faible fréquence de résistance aux médicaments de & lt;% et ~% parmi les isolats de post-traitement récupérés chez les adultes et les enfants, respectivement [, -] Petites études japonaises impliquant un traitement à l’oseltamivir pour les enfants atteints du sous-type HN de la grippe A et du sous-type HN de la grippe A ci-après d) grippe A / HN et influenza A / HN ont rapporté des taux de résistance aux médicaments de% et% dans les isolats post-traitement, respectivement Une excrétion virale persistante a été observée chez les enfants traités par oseltamivir avec grippe B Cependant, au Japon , l’oseltamivir est généralement administré à la posologie de mg / kg deux fois par jour; cette dose entraîne une baisse des concentrations plasmatiques chez les enfants, comparativement à la posologie graduée en fonction du poids qui est utilisée dans le reste du monde. Les enfants atteints de la grippe présentent des taux d’excrétion virale plus élevés que les adultes. Pour déterminer si l’utilisation d’un traitement à base d’oseltamivir à plusieurs niveaux contre l’influenza A et B supprimerait l’émergence d’une pharmacorésistance, nous avons prélevé des échantillons nasopharyngés en série avant et après le traitement pour isoler le virus. pour quantifier l’excrétion virale et pour détecter la présence de virus pharmacorésistants

Patients et méthodes

EnrôlementNotre étude a été menée à l’unité d’enfants de Leicester Royal Infirmary Leicester, Royaume-Uni de janvier à avril et les enfants âgés de – ans qui se sont présentés à l’unité dans h après le début des symptômes fébriles généralement, mais pas exclusivement, fièvre [température, ⩾ ° C] Roche diagnostique Des enfants ayant des échantillons positifs pour le virus de la grippe se sont vu offrir de l’oseltamivir en suspension pédiatrique deux fois par jour pendant plusieurs jours selon le régime posologique pondéré en fonction du poids mg / le jour a été donné aux enfants pesant & lt; kg, mg / jour a été donné aux enfants pesant – kg, mg / jour a été donné aux enfants pesant – kg, et mg / jour a été donné aux enfants pesant & gt; Les critères d’exclusion étaient l’allergie à l’oseltamivir, l’immunosuppression cliniquement significative, le traitement concomitant nécessitant un ajustement de la dose d’oseltamivir ou l’impossibilité d’obtenir des échantillons cliniques. Isolement et excrétion du virusNous visions à prélever des échantillons nasopharyngés sur tous les enfants avant le jour du traitement. – après le début du traitement, les jours suivant l’instauration du traitement et, au cours de la deuxième année de l’étude, les jours suivant l’instauration du traitement. Les symptômes cliniques ont été enregistrés à chaque visite à, tous les contacts familiaux de l’enfant. L’échantillon de rhinopharynx a été prélevé – quelques jours après la présentation de l’enfant à l’hôpital, peu importe si le contact avait des symptômes. Les échantillons cliniques ont été conservés en mL du milieu de transport du virus et congelés à – ° C jusqu’à l’analyse. échantillons cliniques les moins du Chili Huit enfants ont été exclus: avaient une infection mixte de grippe A et B, et n’avaient aucun virus récupérable à partir d’un échantillon malgré un résultat positif au test antigénique rapide. L’étude était donc composée de patients enfants – avec virus grippal confirmé. Trente-cinq enfants La grippe A / HN, la grippe A / HN et le virus grippal B ainsi que le virus grippal A / HN ont tous été évalués conception. Les participants étaient en général en bonne santé, à l’exception d’une jeune fille de myasthénie qui avait une l’âge médian des participants était les années, la fourchette du mois, – les années, les mois; % étaient âgés & lt; années Il n’y avait pas de différences cliniquement significatives dans les caractéristiques démographiques par sous-types de virus, sauf qu’il y avait plus d’enfants asiatiques dans le groupe influenza A / HN P = Parents d’enfants% déclaraient seulement une observance partielle du traitement par oseltamivir; la non-conformité était principalement attribuée au goût désagréable du médicament

Tableau View largeTélécharger slideCaractéristiques de base des enfants atteints de grippe traités par oseltamivirTable View largeTélécharger slideCaractéristiques de base des enfants atteints de grippe ayant reçu un traitement par oseltamivir Isolation du virus et concentrations inhibitrices% IC Canins Les cellules rénales surexprimant le gène ß-galactoside-α -, – sialyltransférase I utilisé pour isoler les virus des échantillons cliniques Le IC & gt; d’isolats de virus à l’oseltamivir carboxylate Roche et zanamivir GlaxoSmithKline ont été déterminés en utilisant un test d’inhibition de la neuraminidase à base de fluorescence Le IC & gt; a été déterminée sur la base de la concentration de médicament à laquelle il y avait une réduction de% de fluorescence; La RT-PCR en temps réel multiplex a été réalisée sur de l’acide nucléique extrait directement d’échantillons cliniques, qui ont été élués dans un volume de μL, en utilisant les colonnes Qiagen Primers et des sondes ciblant les régions conservées du Le gène HA des virus H, H et B a été utilisé. La RT-PCR a été réalisée avec un mélange réactionnel de -μL avec une matrice extraite en μL; μL × RT Mélange réactionnel PCR SuperScript III Trousse quantitative RT-PCR en une étape; Invitrogen; nmol / L de chacune des amorces H et H avant et arrière; nmol de chacune des amorces B; nmol / L H, nmol / L H, et nmol / L B TaqMan mineures sondes de liaison de rainure; μL SuperScript III RT / Platinum Taq mix; et μL ROX Reference Dye L’amplification, la détection et l’analyse des données ont été effectuées sur un cycleur thermique en temps réel ABI Prism. Des échantillons cliniques dans lesquels l’ARN viral a été détecté ont été dopés avant l’extraction des acides nucléiques avec un ARN synthétique exogène des courbes ont été préparées à partir de virus A / NewCaledonia // HN, A / Wisconsin // HN et B / Malaysia // couvrant une gamme d’infectiosité virale de – log & gt; unités formant des plages / mL – ×, – ×, – × unités formant des plaques / mL, respectivement Les charges virales ont été déterminées dans des échantillons en testant en triple et en calculant une valeur moyenne Séquençage du gène de la NaminaminidaseLes gènes N et N complets ont été amplifiés Des matrices d’ADN et des amorces de séquençage ont été préparées pour le séquençage du cycle Le pyroséquençage GATC a été utilisé pour détecter et quantifier les mutations de résistance aux inhibiteurs de la neuraminidase directement à partir d’échantillons cliniques PCR et des amorces marquées à la biotine Les échantillons ont été pyroséquencés à l’aide du kit de pyroséquençage Pyrogold. Toutes les amorces ont été achetées chez Eurofins Ebersberg, et les amorces marquées à la biotine ont été purifiées en utilisant un liquide à haute performance. Chromatographie Des sondes ont été obtenues à partir de Applied Biosy Tiges Toutes les séquences d’amorces et de sondes et les conditions de thermocyclage pour toutes les procédures sont disponibles sur demandeMéthodes statistiquesNous avons utilisé χ & gt; tests pour comparer les variables non continues et le test exact de Fisher lorsque le nombre d’observations attendues était & lt; Si les variables étaient normalement distribuées, les valeurs moyennes ont été comparées en utilisant le test t de Student pour les groupes ou l’analyse de la variance pour les groupes; si la variable était distribuée de manière non normalisée, des tests U de Mann-Whitney ou des tests de Kruskal-Wallis ont été utilisés P & lt; a été considéré comme un logiciel Stata statistiquement significatif, version; StataWritten le consentement éclairé des parents a été obtenu L’étude a été approuvée par un comité d’éthique indépendant, University Hospitals Leicester, et l’Agence de réglementation des médicaments et des produits de santé

Résultats

Détection de virus avant et après traitement par oseltamivir L’influenza dans des échantillons cliniques séquentiels, obtenus avant et après traitement à l’oseltamivir, a été détectée par RT-PCR pour le gène hémagglutinine et l’isolement du virus Figure Parmi les enfants ayant un ARN viral détecté par RT-PCR,% cultivé dans les échantillons de prétraitement Par jours – jour médian, après le début du traitement à l’oseltamivir, des enfants avec des échantillons testés,% avaient un virus détectable par RT-PCR, et% avaient un virus détectable par culture Par jours – médiane, des enfants avec échantillons Des différences statistiquement significatives entre les taux de détection par RT-PCR ou la culture entre les sous-types viraux lors de toute visite de post-traitement ont été observées. En% des enfants, tous atteints de la grippe A / HN virus, a eu des échantillons obtenus les jours – jour médian, et tous les échantillons ont été négatifs pour le virus de la grippe par RT-PCR et la culture

Figure Vue largeDownload slideRates de détection du virus de la grippe par PCR et culture d’échantillons nasaux cliniques obtenus avant et après traitement par oseltamivir * Un patient a eu un résultat positif d’un test rapide d’antigène mais des résultats négatifs de PCR et de culture le jour. détection d’un virus grippal par PCR et culture d’échantillons nasaux cliniques obtenus avant et après traitement par oseltamivir * Un patient a eu un résultat positif à un test rapide d’antigène mais résultats négatifs de PCR et de culture le jour Détermination de IC des inhibiteurs de neuraminidase IC d’oseltamivir et le zanamivir [données non présentées] pour tous les isolats de virus prétraitement et posttraitement obtenus ont été comparés à ceux des isolats grippaux communautaires acquis au Royaume-Uni à partir des saisons grippales – et – aucun virus de l’étude prétraitement n’a montré une sensibilité réduite aux inhibiteurs de la neuraminidase; la moyenne IC & gt; d’oseltamivir était nmol / L% CI, – nmol / L pour grippe A / HN, nmol / L% CI, – nmol / L pour grippe A / HN, et nmol / L% CI, – nmol / L pour virus grippal B Il n’y avait pas de changement statistiquement significatif dans la moyenne IC & gt; de l’oseltamivir pour les isolats du virus de la grippe B récupérés après traitement oseltamivir moyen IC> nmol / L; % CI, – nmol / L Cependant, en jours -, les isolats viraux de% d’enfants ayant des virus grippaux A / HN et de% d’enfants ayant un virus grippal A / HN présentaient une réduction de la sensibilité à l’oseltamivir de Chez ces patients, le virus était indétectable par RT-PCR ou culture le jour, ce qui indiquait la clairance du virus pharmacorésistant. Cependant, un virus supplémentaire de la grippe A / HN, isolé le jour d’un enfant différent, a montré une réduction de la sensibilité à l’oseltamivir> L’isolat de l’influenza A / HN présentait une réduction de la sensibilité au zanamivir, contrairement aux isolats de l’influenza A / HN, qui conservaient la sensibilité au zanamivir. enfant chez qui un virus pharmacorésistant a été isolé Globalement, des virus résistants aux antiviraux ont été retrouvés chez des enfants atteints de grippe A / HN,% d’enfants atteints de grippe A / HN et enfants atteints du virus de la grippe B, tous traités par l’oseltamivir P =, pour le virus de la grippe A / HN contre le virus de la grippe A / HN

Vue de la figure LargeDownload slideBox tracé des concentrations inhibitrices% IC & gt; Dans notre étude, nous avons comparé l’oseltamivir dans les virus de la grippe A / HN a, influenza A / HN b et influenza B c par rapport aux isolats de virus grippaux communautaires acquis au Royaume-Uni à partir des saisons grippales. virus résistants chez les patients, et influenza A / HN et patient grippe A / HN sont représentés par des étoiles Les isolats de virus sensibles à la drogue sont représentés par des cercles noirs La moyenne IC & gt; des isolats du Royaume-Uni est représenté par des barres noires verticalesFigure View largeDownload slideBox tracé des concentrations inhibitrices% IC & gt; Dans notre étude, nous avons comparé l’oseltamivir dans les virus de la grippe A / HN a, influenza A / HN b et influenza B c par rapport aux isolats de virus grippaux communautaires acquis au Royaume-Uni à partir des saisons grippales. virus résistants chez les patients, et influenza A / HN et patient grippe A / HN sont représentés par des étoiles Les isolats de virus sensibles à la drogue sont représentés par des cercles noirs La moyenne IC & gt; des isolats britanniques est représentée par des barres noires verticales

Figure Vue largeDownload slideExpulsion quantitative virale du virus nasal chez les enfants ayant développé une infection par des souches de virus grippal A résistantes aux médicaments, virus influenza A / HN sensibles aux médicaments b, virus A / HN sensibles aux médicaments c, virus influenza B sensible aux médicaments ex., virus de la grippe A, virus de la grippe A / HN b, virus de la grippe A / HN sensible aux médicaments c , virus de la grippe B sensibles à la drogue d souches pfu, unités formant des plaques

Caractéristiques des enfants présentant des isolats de virus de la grippe post-traitement présentant une sensibilité réduite aux inhibiteurs de la neuraminidase Séquençage de la neuraminidaseLe pyroséquençage du gène de la néraminidase a été effectué sur le matériel d’acide nucléique extrait directement des échantillons cliniques. ; Ces mutations ont été confirmées par l’analyse de la séquence complète des gènes de la neuraminidase de tous les virus. Charge virale quantitative et excrétion des titres viraux dans des échantillons cliniques séquentiels. ont été mesurés directement par PCR quantitative Par jours -,% d’enfants atteints de grippe A / HN,% d’enfants atteints de grippe A / HN et d’enfants infectés par le virus B avaient des titres viraux accrus Les isolats cultivables étaient sensibles à l’oseltamivir; P =; À ce moment, les enfants%,% et%, respectivement, avaient éliminé le virus infectant. P = En jours -, les proportions d’enfants traités par oseltamivir avec influenza A / HN, influenza A / HN ou influenza B ayant éliminé le virus augmentaient à% de,% de, et% de, respectivement P = Trois enfants avec grippe A / HN et enfant avec virus grippal B ont montré une augmentation de la charge virale par PCR pendant jours – et -; bien qu’aucun virus cultivable n’ait été isolé, tous les enfants avaient complètement récupéré et étaient asymptomatiques au moment de l’obtention des échantillons. Symptômes cliniques Les enfants chez qui des virus résistants aux antiviraux ont été récupérés ont été traités en ambulatoire; ils étaient afebriles par jours – et entièrement récupérés par jours – tableau Aucun symptôme prolongé ou augmenté ont été observés chez les enfants infectés par des virus résistants aux antiviraux, comparés aux enfants chez lesquels des virus antiviraux-sensibles ont été récupérés Le nombre d’enfants symptomatiques avaient des virus de la grippe A / HN sensibles aux antiviraux, A / HN et B étaient des%, des% et des% de, respectivement Par jours -, le nombre d’enfants symptomatiques avait diminué à%,% et% de, respectivement, des enfants avec une charge virale détectable les jours -, avec la grippe A / HN, avec la grippe A / HN, et avec le virus de la grippe B, tous étaient afébriles, et seulement%; Au cours de l’étude, les enfants ont eu besoin de soins intensifs pour un sepsis systémique ou une insuffisance respiratoire. Tous ont été infectés par des virus grippaux A / HN entièrement sensibles aux médicaments, n’ont pas isolé d’organismes bactériens et se sont complètement rétablis. des contacts étaient des adultes âgés de ⩾ ans provenant de différents ménages d’enfants traités par oseltamivir et infectés par le virus de la grippe A / HN au cours de la deuxième année – jour médian, indépendamment du fait que les contacts avaient des symptômes. Le virus HN par RT-PCR, et% étaient positifs pour le virus de la grippe A / HN par culture Aucun isolat n’a montré de CI réduit & gt; la sensibilité aux médicaments, et le pyroséquençage du gène de la neuraminidase n’a révélé aucune mutation connue pour être associée à la résistance aux antiviraux

Discussion

La neuraminidase grippale est essentielle pour la libération et la propagation de nouveaux virions provenant de cellules infectées Neuf sous-types de virus de la neuraminidase A N-N de la grippe A sont identifiés dans la nature; ils sont classés en groupes sur la base des caractéristiques structurelles, comme suit: groupe N, N, N et N, groupe N, N, N, N, et N neuraminidase Les groupes N et N diffèrent avec Concernant la structure d’une poche adjacente au site actif de l’enzyme neuraminidase Les inhibiteurs actuels ont été conçus à partir de l’analyse structurale du sous-type N, dans le but d’étudier l’activité de toutes les neuraminidases A et B. mais la présence de HY dans le groupe N mais pas de groupe N neuraminidase perturbe le site de liaison et réduit la sensibilité aux médicaments Autres changements d’acides aminés dans ou autour du site actif, principalement RK ou EV dans N et RK ou DN dans B neuraminidase réduire la sensibilité du virus à l’oseltamivir La fixation du zanamivir n’est généralement pas affectée par les changements conformationnels conférés par l’HY; les souches N résistantes à l’oseltamivir restent sensibles au zanamivir. Cependant, une résistance croisée avec la mutation N RK, comme cela a été observé dans notre étude, est reconnue Comme dans les rapports antérieurs impliquant des enfants dont les échantillons étaient isolés après le traitement. , nous n’avons trouvé aucune preuve d’une maladie prolongée Les patients infectés par des virus grippaux A / HN porteurs d’HY qui continuaient à avoir des virus détectables après la journée étaient tous deux asymptomatiques. Un virus cultivable a été détecté dans un échantillon uniquement de ces patients; ceci a indiqué la clairance du virus viable de% des enfants dans notre étude qui ont développé une infection avec des souches pharmacorésistantes La capacité des virus résistants aux inhibiteurs de la neuraminidase à infecter et à transmettre dans des modèles animaux varie sur la base de la mutation. semblent être compromis, et d’autres isolats et virus de l’influenza A / HN porteurs de l’HY recombinant restent aussi pathogènes et transmissibles que les souches de type sauvage, ce qui suggère que les gènes de fond déterminent également la forme l’introduction des inhibiteurs de la neuraminidase dans la pratique clinique, le réseau Neuraminidase Inhibitor Susceptibility Network a été établi pour surveiller les isolats de grippe. Avant, la surveillance annuelle identifiait de faibles niveaux de résistance aux inhibiteurs de la neuraminidase naturelle parmi les souches de virus grippaux A et B -] De note, au Japon, où il y a la plus haute fréquence d’utilisation de prescr ibed oseltamivir per capita, aucune accumulation de résistance aux médicaments n’a été observée dans les isolats d’influenza A / HN acquis dans la communauté; les fréquences de la résistance phénotypique étaient de%,% et & lt;% dans les saisons grippales, – et -, respectivement. La prévalence de la pharmacorésistance parmi les souches du virus grippal B n’est pas bien étudiée, mais faible résistance aux médicaments De manière inattendue, la saison grippale dans l’hémisphère nord a été caractérisée par la circulation de virus de l’influenza A / HN porteurs de l’HY avec une résistance élevée à l’égard de l’influenza aviaire. oseltamivir Des isolats ont été identifiés en Europe, en Amérique du Nord et en Asie; les proportions d’isolats résistants à l’oseltamivir étaient de ~% aux Etats-Unis, au Royaume-Uni et à Hong Kong; ~% Au Canada et en Allemagne; et ~% en Norvège Ces proportions étaient en contraste avec celles observées au Japon ~% La source de ces virus porteurs d’HY est incertaine, car les rapports de tous les pays indiquent un manque d’exposition à l’oseltamivir chez les patients atteints. L’émergence imprévue de et les virus pathogènes de l’influenza A / HN sont conformes à nos constatations selon lesquelles il existe une faible barrière génétique à l’oseltamivir parmi les virus de l’azote qui ne peut être surmontée par un dosage en fonction du poids, comme on peut le voir avec les virus N et B. Il est prudent de prendre des dispositions pour les cas de pharmacorésistance dans les plans de lutte contre les pandémies et pour augmenter les stocks de médicaments avec des agents antiviraux alternatifs. La surveillance épidémiologique, y compris la détermination de la résistance aux médicaments, est essentielle pour mettre à jour les directives de prescription pour la prise en charge de la grippe saisonnière Parce qu’un vaccin spécifique ne sera pas disponible au début de la prochaine pandémie, les antiviraux devraient jouer un rôle crucial dans la réduction de la transmission du virus et de la morbidité associée au début de la grippe . La planification prépandémique dépend fortement du stockage des médicaments Combinaisons de médicaments inhibiteurs de la neuraminidase surmonter la pharmacorésistance conférée, et le développement de nouveaux agents antigrippaux devrait être envisagé, pour maintenir des stocks cliniquement efficaces et une préparation à jour pour les pandémies

Remerciements

Hoffman LaRoche, Novartis Vaccines, l’Union européenne et le UK Medical Research Council ont reçu des subventions de Hoffman LaRoche, de Novartis Vaccines, de GlaxoSmithKline et de Biocryst Pharmaceuticals. KN a reçu un soutien pour sa participation aux réunions de Hoffman LaRoche KN a reçu un financement de recherche de Novartis Vaccines, Wyeth, Conseil de recherche médicale du Royaume-Uni, Health Technology Assessment, GlaxoSmithKline et Baxter ainsi que des honoraires de consultation et de conseil de Novartis Vaccines , GlaxoSmithKline, et Baxter JS est un employé de Hoffman LaRoche Tous les autres auteurs: no conflicts