Caractérisation biochimique d’un isolat de virus, récupéré d’un patient atteint de kératite herpétique, cliniquement résistant à l’acyclovir

Les épreuves de sensibilité in vitro du virus de l’herpès simplex ne correspondent pas nécessairement aux résultats du traitement. Un isolat HSV de type HSV, récupéré chez un patient présentant une kératite herpétique avec immunosuppression localisée, a été caractérisé pour sa sensibilité bien que le% de concentration inhibitrice isoler était inférieur au point de rupture accepté pour définir la résistance à l’acyclovir & gt; μg / mL, les éléments de preuve suivants suggèrent que l’isolat était résistant à l’acyclovir: l’histoire clinique a confirmé que l’infection ne réagissait pas à l’acyclovir; la sensibilité in vitro était similaire à celle d’un SLU du virus de la thymidine kinase TK négatif, résistant à l’acyclovir; le CI de l’acyclovir était plus de fois le CI pour une souche témoin sensible à l’acyclovir; les isolats clonaux purifiés sur plaque étaient résistants aux CI d’acyclovir, & gt; pg / ml; Des études biochimiques ont indiqué que le TK HSV-N était partiellement altéré pour la phosphorylation de l’acyclovir. Bien que des changements de résidus aient été observés dans les régions codant le tk et le pol du HSV-N, la caractérisation d’un virus recombinant exprimant la et Pol ont conféré ensemble le phénotype de résistance à l’acyclovir

Le virus de l’herpès simplex résistant aux antiviraux est prévalent dans la population immunodéprimée , et il existe un risque que les infections à HSV deviennent chroniques chez ces personnes Un certain nombre de tests in vitro sont utilisés pour évaluer la sensibilité du VHS aux antiviraux. agents ; Cependant, il existe des limites à la précision de l’identification des souches de VHS résistantes aux antiviraux. Ces limitations résultent en grande partie de l’absence d’un panel accepté de souches de VHS standard bien caractérisées, incluant les phénotypes résistants à l’acyclovir et sensibles à l’acyclovir; L’échec des chercheurs à inclure systématiquement le même virus témoin sensible aux médicaments dans chaque essai contribue également à ces limitations. Jusqu’à présent, l’essai de réduction de plaque PRA reste le seul test dans lequel une corrélation a été établie entre la concentration d’inhibition inhibitrice déterminée en laboratoire. et le résultat clinique de la maladie En fait, un point de rupture in vitro pour définir la résistance à l’acyclovir a été fixé à μg / mL sur la base de la corrélation entre IC et réponse clinique au traitement antiviral “Résistance au penciclovir” a été défini par les critères suivants: un IC qui est plus grand que le CI pour un virus de contrôle sensible au penciclovir utilisé dans un test particulier, ou comme IC de & gt; μg / mL Les critères susmentionnés ont été évalués dans la présente étude pour déterminer si un isolat était résistant à l’acyclovir ou au penciclovir. Nous rapportons l’isolement d’une souche du virus HSV de type HSV résistante à l’acyclovir cultivée à partir d’un échantillon cornéen obtenu à partir de un patient qui ne répondait pas au traitement par l’acyclovir Le CI de l’isolat du patient était & lt; μg / mL lors d’essais sur l’acyclovir, ce qui suggère que l’isolat était sensible à l’acyclovir; cependant, le CI était> plus grand que le CI du virus de contrôle sensible aux médicaments lorsqu’il est testé en utilisant le même test, ce qui suggère que le virus était résistant à l’acyclovir. Nous présentons des preuves pour confirmer que le phénotype était résistant à l’acyclovir

Matériaux et méthodes

Traitement des patients Les médicaments utilisés pour le traitement étaient des gouttes de phosphate de dexaméthasone; % de solution donnée – fois par jour, onguent topique d’acyclovir pommade, administré soit par jour pour le traitement de l’infection aiguë, soit par jour pour le traitement d’entretien, acyclovir par voie orale mg fois par jour, foscarnet iv par voie topique g / mL et œil trifluridine gouttes opthiole collyre; Isolement HSV Des échantillons de frottis d’ulcère cornéen ont été obtenus et inoculés dans des flacons doubles contenant des fibroblastes en mL de milieu de culture Dulbecco modified Eagle medium avec du sérum de veau foetal et des antibiotiques Les flacons Shell ont été centrifugés à g pendant min et incubés toute la nuit à ̊C Pendant une semaine, les cultures ont été examinées quotidiennement pour l’effet cytopathique, et la suspension cellulaire a été congelée et décongelée pour libérer le virus associé aux cellules lorsque l’infection était complète. La préparation virale résultante a été stockée à -̊C Le virus a été typé en utilisant un test d’immunofluorescence, selon les recommandations du fabricant DAKO Deux plaques, représentant les isolats clonaux de N- et N-, ont été prélevées au hasard et purifiées, à homogénéité, pour caractérisation lignées cellulaires et souches de virus MRC-American Type Culture Collection, une lignée de cellules pulmonaires embryonnaires humaines diploïdes et la thymidine kinase TK-American Type Culture Collection, une lignée cellulaire d’ostéosarcome humain, cultivés dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco supplémenté de% de sérum de veau fœtal et incubés à ̊C dans des cellules% CO D, une lignée dérivée de cellules TK de rein de hamster bovin et exprimant constitutivement un gène tk HSV, ont été aimablement fournis par H Field University of Cambridge, Cambridge, Royaume-Uni Ces cellules transformées ont été maintenues dans du milieu Eagle modifié avec% de sérum de veau et hypoxanthine, aminoptérine et thymidine supplément SLU, un isolat HSV déficient en TK résistant à l’acyclovir et exprimant l’activité TK% , a été fourni par l’Ecole de Médecine de l’Université St Louis d’E Swierkosz, St Louis Les deux HP, qui est un ADN viral HSV qui contient une insertion de gène LacZ ß galactosidase dans la région codant l’ADN Pol, et une lignée cellulaire complémentaire exprimant le PolVB du HSV. ont été gracieusement fournis par l’Université D Coen Harvard, Boston La région codant pour le HSV-N pol a été cotransfectée avec l’ADN viral HP dans des cellules Vero, et le virus résultant a été purifié sur plaque jusqu’à homogénéité. La région codant pour Pol a été séquencée à partir du virus recombinant HP / HSV-N et a été confirmée être identique à la séquence pol provenant des composés HSV-N et N. L’acyclovir a été obtenu auprès de Sigma St Louis Penciclovir a été synthétisé chez GlaxoSmithKline Collegeville, Pennsylvanie. Pour les dosages en culture cellulaire, des solutions mères de mg / mL ont été préparées dans du diméthylsulfoxyde et conservées à -̊CIntensitométrie in vitro. Des ARP ont été réalisés comme décrit ailleurs facial. Le Hybriwix DNA Hybrid Diagnostic Hybrids a été réalisé selon les recommandations du fabricant. a été déterminée en utilisant une modification de la méthode décrite par Coen et al et rapportée ailleurs H-acyclovir a été synthétisé aux laboratoires GlaxoSmithKline Collegeville, PennsylvanieSéquençage Le gène HSV tk a été amplifié et séquencé comme décrit ailleurs Le gène HSV pol a été séquencé en utilisant des amorces chevauchantes pour le séquençage du cycle de l’ADN polymérase de l’unité formant la plaqueAntibodies et Analyse par transfert de Western Un antisérum polyclonal de lapin élevé à une protéine de fusion glutathion-S-transférase / HSV TK a été généreusement fourni par l’Université de Pennsylvanie, l’antisérum polyclonal de HSV DNA Polv et le protocole Western blot ont été décrits ailleurs.

Résultats

Antécédents du patient Un homme immunocompétent âgé de 11 ans atteint de diabète sucré et de kératite herpétique discale présentait à l’hôpital des épisodes récurrents d’épisodes de kératite herpétique discale – et d’épisodes de kératopathie épithéliale – depuis la durée du traitement aigu, & lt; Pour minimiser les récidives pendant que le patient recevait un traitement stéroïdien, une application topique à long terme de l’acyclovir à une dose et à une fréquence plus faibles que celles de l’acyclovir était nécessaire pour traiter l’inflammation cornéenne et l’infection virale. celle utilisée pendant le traitement aigu a été utilisée à titre préventif après des épisodes de traitement par l’acyclovir topique et la dexaméthasone pendant des mois, un traitement par la trifluorothymidine topique et la dexaméthasone pendant des mois et un traitement par l’acyclovir et la dexaméthasone par voie orale pendant une année. Le traitement par la trifluorothymidine a été initié dans ces cas. L’isolat du virus caractérisé ici a été cultivé pendant l’épisode, au cours duquel le patient n’a pas réagi au traitement. Pical acyclovir onguent Zovirax et la thérapie de trifluorothymidine

Figure Vue largeTéléchargement de diapositive Antécédents de traitement pour un patient infecté par le virus de l’herpès simplex N Ce schéma montre les traitements pour les épisodes de kératopathie discopathique – et les épisodes de kératopathie épithéliale – puisque les thérapies comprenaient l’acyclovir ACV topique ou oral, la dexaméthasone topique Dex, la trifluorothymidine topique TFT , et iv foscarnet solution appliquée par voie topique L’isolat caractérisé dans cet article a été récupéré au cours de l’épisode ligne pointillée, la durée de la thérapie aiguë, & lt; journées; Ligne dure, traitement d’entretien à plus long terme La durée du traitement est détaillée dans la section «Résultats»; ■, dans le temps où le patient ne répondait pas au traitement topique par l’acyclovir et quand le traitement par acyclovir était interrompuFigure Vue grandDownload slideHistoire du traitement d’un patient infecté par le virus de l’herpès simplex N Ce schéma montre les traitements pour les récurrences d’épisodes herpétiques kératopathiques. épisodes de kératopathie – puisque les thérapies de traitement comprenaient ACV acyclovir topique ou orale, dexaméthasone topique Dex, topique trifluorothymidine TFT et solution de foscarnet iv appliquée par voie topique L’isolat caractérisé dans cet article a été récupéré pendant l’épisode Ligne pointillée, durée de la thérapie aiguë, & lt; journées; Ligne dure, traitement d’entretien à plus long terme La durée du traitement est détaillée dans la section «Résultats»; ■, les moments où le patient ne répondait pas au traitement topique par l’acyclovir et où le traitement par acyclovir était interrompuPRA Un isolat de HSV, HSV-N, a été récupéré de la cornée du patient susmentionné qui n’avait pas répondu au traitement par l’acyclovir; l’isolat a ensuite été cultivé. L’isolat a ensuite été testé pour sa sensibilité à l’acyclovir et au penciclovir en utilisant les virus PRA HSV-F et HSV-SLU, les virus témoins qui représentent les étalons de virus sensibles à l’acyclovir et à l’acyclovir respectivement ont été testés en parallèle. avec HSV-N Pour définir un isolat comme “résistant aux médicaments dans les cellules MRC”, il doit avoir un IC de & gt; μg / mL, selon le point de cassure établi pour définir la résistance à l’acyclovir. En variante, selon le “critère -fold” mentionné ci-dessus, si l’on utilise HSV-F comme souche témoin sensible au médicament, la CI de l’acyclovir doit être & gt; μg / mL et la CI du penciclovir doit être de μg / mL, étant donné que les IC pour HSV-F étaient de μg / mL pour l’acyclovir et de μg / mL pour les IC de penciclovirHSV-N étaient & lt; μg / mL pour l’acyclovir et le penciclovir dans le tableau des cellules MRC- En utilisant ce même test, le HSV-SLU, qui exprime l’activité TK des données & lt;% non montrées et qui est caractérisé comme un virus TK négatif, avait un IC de l’acyclovir qui était similaire à celui du HSV-N; cependant, il était encore inférieur au point de rupture de μg / mL pour la résistance à l’acyclovir. Les CI du penciclovir sont également restés inférieurs aux points de rupture de μg / mL et de la résistance multiplicative. Comme cela a été rapporté ailleurs , les CI du penciclovir supérieures à celles de l’acyclovir lors de tests dans des cellules MRC- En outre, HSV-N est resté très sensible à la bromovinyldeoxyuridine, un autre antiviral activé par les TK, avec des CI de & lt; μg / mL Les analyses PRA des isolats clonaux de HSV-N N- et N- ont révélé que les CI de l’acyclovir étaient & gt; μg / mL, alors que les CI du penciclovir pour les mêmes échantillons sont restés & lt; Données μg / mL non affichées

Tableau View largeTélécharger la sensibilité antivirale du virus de l’herpès simplex type HSV-N, tel que déterminé par l’utilisation de l’essai de réduction de la plaque dans les cellules MRC-Table View largeTélécharger la sensibilité antivirale du virus de l’herpès simplex type HSV-N, déterminée par l’essai de réduction MRC- cellsBiochemical assays Pour déterminer si HSV-N ou les isolats clonaux N- et N- exprimaient un polypeptide TK mutant, l’expression génique virale a été examinée au moyen d’une analyse par transfert de Western. Les lysats cellulaires totaux apparus après infection virale ont été sondés avec un antisérum spécifique à le virus viral TK figure HSV-N et les isolats clonaux ont produit une protéine kDa pleine longueur qui a réagi avec l’antisérum TK et qui était similaire en taille et en niveau d’expression à la protéine générée par une infection par le virus HSV-F sensible à l’acyclovir. blot qui a utilisé l’antisérum contre l’ADN viral Pol a montré que les niveaux de polymérase exprimés par les virus sensibles au Les virus qui contiennent des mutations de décalage de cadre dans le gène tk devraient exprimer des TK tronqués et / ou des produits étendus, bien que la résistance à l’acyclovir puisse également se produire grâce à des mutations ponctuelles dans la région codante tk sans altérer la taille ou le niveau d’expression du polypeptide

Figure Vue largeDownload slide Western blot analyse de thymidine kinase TK produits protéiques à partir d’isolats de virus herpès simplex HSV Le produit protéique TK de pleine longueur est ç kDa Le transfert de haut représente les produits TK produits par HSV-souche F de type sauvage sensible HSV- et le HSV- Isolat N Le transfert par le fond décrit les produits TK exprimés à partir d’isolats clonaux HSV-N, N- et N-Mock, extrait cellulaire infecté par Fock Voir grandDownload glissement Western blot de thymidine kinase TK produits protéiques à partir d’isolats HSV du virus de l’herpès simplex Les savoirs traditionnels complets le produit protéique est ç kDa La tache supérieure représente les produits TK produits par la souche HSV-F de type HSV sensible de type sauvage et l’isolat HSV-N La tache de fond représente les produits TK exprimés à partir d’isolats clonaux HSV-N, N- et N- Mock, Extrait de cellules infectées par des simulacres La plupart des mutations résistantes à l’acyclovir qui ont été caractérisées à ce jour sont négatives à la TK En conséquence, un test biochimique sur les savoirs traditionnels a été effectué pour déterminer si le VHS-N produisait une fonction. protéine TK nal L’infection par Mock avec des cellules d’ostéosarcome humain infectées par TK-négatif et des extraits de cellules infectées par la mutation de délétion TK-négative connue, HSV-SLU , était inférieure à la limite de détection de l’activité TK du test TK, & lt % Les extraits de cellules infectées par le virus témoin HSV-F de type sauvage ont été fixés à% HSV-N et les isolats clonaux à la thymidine N- et N- phosphorylée à des niveaux similaires à ceux de la figure HSV-type sauvage. Le mélange N a présenté une activité de% TK; l’aptitude à phosphoryler la thymidine est un indicateur de la fonction de la TK et la phosphorylation primaire du HSV-N était sensible à la bromovinyldeoxyuridine, ce qui suggère que le HSV-N est compétent soit pour le transfert de la thymidine, soit pour la phosphorylation de la thymidine. deuxième groupe phosphate sur cet agent antiviral ou sur la phosphorylation secondaire Cependant, il restait possible que le potentiel d’altération dans la voie d’activation de la phosphorylation des nucléosides soit spécifique de l’acyclovir. Pour pallier cette éventualité, la capacité du TK du HSV-N à phosphoryler le L’acyclovir et le penciclovir ont été examinés plus efficacement que l’isolat de HSV-N ou les isolats clonaux purifiés sur plaque, ce qui indique que le HSV-N exprime un produit de protéine TK altéré avec une altération de la reconnaissance de l’acyclovir HSV- N ne se distinguait pas identifiable de HSV sensible aux médicaments – en ce qui concerne la phosphorylation de penciclo La détermination virSequence de la région codante tk à partir des isolats clonaux a montré des substitutions d’acides aminés, en comparaison avec les gènes tk des souches HSV sensibles aux médicaments détaillées dans GenBank http: // wwwcnbinlmnihgov / In HSV-N- et N-, la méthionine au résidu avaient changé en leucine et la glycine au niveau du résidu avait été modifiée en acide glutamique. Ces changements ne se situent pas directement dans les domaines proposés de l’adénosine triphosphate ou du site de liaison aux nucléosides de la TK; Néanmoins, ils peuvent altérer la sensibilité à l’acyclovir, comme indiqué par une mauvaise phosphorylation de H-acyclovirPour évaluer si ces substitutions de résidus étaient uniquement responsables de la contribution au phénotype résistant à l’acyclovir, une ARP a été réalisée en utilisant des cellules exprimant HSV TK. polypeptide peut compenser la TK virale mutante, et les PRA effectuées en utilisant de telles cellules peuvent fournir une indication immédiate quant à savoir si la protéine Pol contient des mutations qui altèrent directement la résistance à l’acyclovir Les CI pour HSV-N et les isolats clonaux, qui expriment l’activité le test biochimique n’a pas complètement sauvé la sensibilité aux niveaux de type sauvage dans les cellules HSV TK. Contrairement au HSV-SLU, qui est connu pour être résistant à l’acyclovir en raison de la production d’une table de protéines TK défectueuse. dans la région codant pour le HSV-N pol peut conférer une résistance partielle supplémentaire à l’acyclovir

Tableau View largeTélécharger la sensibilité antivirale du virus de l’herpès simplex type HSV-N, déterminé par l’utilisation du test de réduction de la plaque dans les cellules HSV-TK-positives Voir tableauTélécharger la sensibilité antivirale du virus de l’herpès simplex type HSV-N, déterminée par Cellules HSV TK-positives Polymérase polymérase recombinante L’analyse de séquence de la région codante pol des isolats clonaux a identifié des différences d’acides aminés, comparées aux virus HSV- de type sauvage détaillés dans GenBank présentés comme acides aminés de type sauvage, nombre de résidus, acides aminés mutants. : E – V, S – N, G – D, S – L, T – M, P – H et A – T Aucun de ces changements ne réside dans les régions hautement conservées de la similarité des séquences protéiques. partagé par HSV Pol et d’autres ADN polymérases Cependant, le changement sérine-leucine au niveau du résidu se situe dans la région A, qui est particulièrement conservée parmi les ADN polymérases sensibles à certains médicaments antiviraux Car les cellules exprimant les TK seulement partiellement sauvé le phénotype résistant à l’acyclovir, ce qui suggère que HSV-N contient des mutations dans les gènes tk et pol, il y avait génération d’un virus recombinant dans lequel la polymérase rompue par LacZ de HSV-HP a été remplacé par le HSV-N- pol région codante pour créer un virus fonctionnel Le séquençage de la région codante pol à partir de ce virus recombinant a confirmé que les changements de résidu présents dans N- ont été maintenus De façon surprenante, ce virus recombinant était sensible à la fois aux IC acyclovir et penciclovir, & lt; μg / mL, déterminé à l’aide de l’ARP dans les cellules MRC- En outre, le virus était sensible au foscarnet et les données sur la bromovinyl-désoxyuridine non présentées

Discussion

L’ARP continue d’être le «gold standard» pour les tests de sensibilité du VHS Pour l’acyclovir, une corrélation entre IC in vitro et résultat clinique a été établie Un isolat HSV a été retrouvé chez un patient atteint de kératite herpétique, puis en culture. testé en utilisant PRA; μg / mL Le traitement par Acyclovir n’a pas résolu l’infection, en particulier parce qu’il peut être difficile de délivrer des concentrations antivirales qui traitent efficacement les infections oculaires. De plus, un traitement concomitant par la dexaméthasone , en plus des concentrations antivirales locales sous-thérapeutiques, peuvent avoir contribué à la sélection de VHS cliniquement résistants. Pour remédier à l’écart apparent entre les résultats in vivo et les tests in vitro, l’isolat clinique et les isolats clonaux ont été caractérisés pour l’activité biologique. La susceptibilité antivirale entre un virus témoin sensible au médicament et les virus expérimentaux est généralement prédictive de la réponse clinique aux médicaments Une augmentation de la résistance d’un facteur compared par rapport au VHS sensible aux médicaments est corrélée aux résultats cliniques Le VHS-N l’isolat clinique était presque -plus résistant à l’acyclovir que était la souche témoin sensible au médicament, HSV-F Par conséquent, l’échec de l’infection par le HSV-N à réagir à l’acyclovir et la différence dans l’ampleur de l’augmentation de la sensibilité par rapport au HSV sauvage suggèrent que cet isolat peut être résistant Les tests biochimiques et in vitro de sensibilité à l’acyclovir ont démontré que les isolats clonaux HSV-N- et N- étaient, en fait, résistants à l’acyclovir, avec des IC significativement supérieurs à μg / mL. Bien que HSV-N ait montré une faible carence en la phosphorylation de la thymidine, la phosphorylation de l’acyclovir était moins efficace que celle du virus de type sauvage Cette propriété altérée par le TK du HSV-N ne peut expliquer que partiellement le phénotype résistant à l’acyclovir, car les cellules exprimant la sensibilité du HSV-N à l’acyclovir était similaire dans les deux cellules MRC- et TK-exprimant les cellules, alors que le SLU-HSV- résistant à l’acyclovir-SLU, qui exprimait l’activité <% TK, avait Dans l'ensemble, ces résultats suggèrent que la protéine altérée par TK produite par HSV-N fonctionne de manière dominante négative, peut-être en dimérisant avec et en perturbant l'activité TK de type sauvage présente dans D. cellules [, ]; et / ou la région de codage pol contribue également à l'analyse du phénotype de résistance au phénotype résistant à l'acyclovir identifié dans le Pol des isolats clonaux, et une de ces mutations était dans une région associée à la sensibilité aux agents antiviraux de la région A. Il a été suggéré que interagit avec les médicaments et les substrats pour rendre les ADN polymérases virales plus sensibles que les Pol α humains à divers médicaments antiviraux Cependant, le virus recombinant HSV-N Pol reste sensible à l'acyclovir et au penciclovir, et ce résultat n'est pas compatible avec la résistance au HSV-N acyclovir. causée par une interaction Pol modifiée avec l'acyclovir-triphosphate Par conséquent, le mécanisme biologique pour expliquer la résistance antivirale observée des isolats HSV-N n'est pas clair à l'heure actuelle Cependant, les données suggèrent que l'interaction des deux protéines mutées du HSV-N avec l'acyclovir entraîne une résistance suffisante pour altérer l'effet clinique de la thérapie, ou L'incapacité du HSV-N à l'acyclovir est due à une région du génome viral distincte de celles dont la résistance médiane a été prouvée antérieurement, à savoir tk et pol. L'incapacité de la lésion HSV-N du patient à répondre au traitement acyclovir pendant l'épisode pourrait être attribuée à Résistance ou incapacité à atteindre des concentrations suffisantes dans l'infection oculaire pour impacter la réplication virale Les données que nous présentons suggèrent que les tests de sensibilité sans mise en œuvre de normes de contrôle appropriées dans chaque test individuel pourraient entraîner une sous-identification des virus pharmacorésistants. en plus du point de rupture standard de μg / mL, peut aider à s'assurer que les laboratoires cliniques identifient suffisamment les isolats résistants aux antiviraux, en particulier dans les cas suivants: la population de patients immunodéprimés. De plus, cela aiderait faciliter l'amélioration de la prise en charge des maladies Des études supplémentaires utilisant des isolats cliniques HSV et HSV sont nécessaires pour évaluer l'impact des critères de test proposés sur la détection des souches antivirales de HSV

Remerciements

Nous remercions S Albelda, H Field, S Safrin et E Swierkosz, pour les dons généreux de réactifs; J Mack, pour la synthèse d’acyclovir radiomarqué; R Boon, pour le soutien financier de la division Consumer Healthcare Weybridge, Royaume-Uni; et K Esser, pour l’examen de ce travail