Analogues rigides des indolobenzazépinones antimitotiques: nouveaux aperçus de la liaison de la tubuline par modélisation moléculaire

La tubuline reste l’une des cibles thérapeutiques majeures pour les composés anticancéreux cliniquement utiles 1, comme en témoigne le succès considérable des vinca-alcaloïdes antimitotiques (vincristine, vinblastine et analogue synthétique navelbine) 2 et des dérivés taxoïdes (taxol et son analogue synthétique taxotère) 3. La complexité structurelle de ces familles de composés a incité les chercheurs à découvrir des structures plus simples ayant des activités antimitotiques. Cela a conduit, par exemple, au développement du N-acétyl-allocolchinol (NAC, 1), 4 un analogue structurel de l’un des premiers agents antimitotiques naturels décrits, la colchicine (2), 5 ainsi que des analogues des combretastines. (3) (voir la Figure 11) .6 Cependant, bien que certains de ces composés ou leurs analogues fassent l’objet d’études cliniques avancées, aucun n’a encore été approuvé en tant que médicament.Figure 1 À cet égard, nous avons récemment décrit une telle famille de les agents antimitotiques de faible poids moléculaire et accessibles par voie synthétique, les indolobenzazépinones C5-alkylés, dont le membre le plus actif était le dérivé (S) -5-éthyle 4.7. Ces derniers ont montré des activités antiprolifératives puissantes dans diverses lignées cellulaires cancéreuses avec, par exemple, une valeur IC50 de 32 nM dans les cellules KB. Le composé 4 a également inhibé la polymérisation de la tubuline avec une CI50 de 1,8 M, se comparant avantageusement aux activités antimitotiques de la colchicine (2, IC50 = 2,2 μ M) et NAC (1, IC50 = 3,0 &#x003bc). M) déterminés dans les mêmes conditions d’essai. En outre, le composé 4 s’est révélé supérieur à la colchicine et à la NAC en réduisant significativement la taille de la tumeur dans le modèle expérimental de gliome greffé sur la membrane chorio-allantoïque de poussin (CAM). Dans le cadre de notre développement continu des relations d’activité pour cette nouvelle famille d’antimitotiques, nous avons préparé des analogues de 4 dans lesquels le cycle de benzazépinone à 7 chaînons relativement flexible était rendu plus rigide par la présence d’un cycle supplémentaire. Le premier d’entre eux, le dérivé indane 5, correspond au composé actif 4 dans lequel le groupe éthyle en C5 est lié au fragment benzo tandis que dans la seconde molécule cible rigide, le même groupe éthyle est maintenant relié à l’atome d’azote du carboxamide. La synthèse du composé 5 est représentée sur le schéma 1. La bromoindanone 7 (8) a été traitée avec du tétra-isopropoxyde de titane et de l’ammoniac en excès dans de l’éthanol pour donner l’imine correspondante, qui a été réduite avec du borohydrure de sodium. amine. Ce dernier était relativement instable et a donc été transformé in situ en le dérivé N-Boc 8, qui a été facilement purifié par Chromatographie. La réaction du composé 8 avec le pinacol borane en présence de diacétate de palladium catalytique et de S-Phos dans le dioxane à 80 ° C a fourni le dérivé de pinocolindane 9.9 Accouplement de Suzuki de ce dernier avec le 1-benzènesulfonyl-3-iodoindole-2-carboxylate d’éthyle 10 (7) utilisant le mélange diacétate de palladium / dppf comme système catalytique et le fluorure de césium comme base donnait le composé 11 avec un rendement d’environ 50% de 8. La déprotection de la fonction amine primaire de 11 en utilisant l’acide trifluoroacétique dans le dichlorométhane a donné le composé 12. le traitement de l’amine 12 avec du sodium dans l’éthanol conduit à la cyclisation et à la déprotection concomitante de l’azote indolique pour obtenir le dérivé indane désiré. 5.Schème 1 Notre seconde molécule cible, le dérivé de pyrrolidine 6, correspond à une version N-alkylée du composé 4. Nous avons précédemment observé que la N-méthylation de l’azote indolique ainsi que la méthylation simultanée de l’indole et du lactame NH étaient préjudiciables à la fois au cytotoxique et au Par conséquent, avant d’entreprendre la synthèse du dérivé de pyrrolidine 6, il semble donc approprié d’étudier d’abord l’effet de la N-alkylation de seulement la fonction lactame de 4 sur l’activité. Par conséquent, pour la comparaison avec 6, nous avons préparé le dérivé N-méthyle 15 (Schéma 2). Pour ce faire, l’indole NH du composé 4 a d’abord été sélectivement protégé par un groupe Boc pour donner 13. La méthylation du lactame NH de 13 a ensuite été effectuée avec de l’iodure de méthyle et de l’hydrure de sodium dans du THF. Le traitement de 14 avec de l’acide trifluoroacétique dans du dichlorométhane a ensuite donné le dérivé monométhylé 15.Schéma 2 Encouragée par les résultats obtenus pour 15 (voir ci-dessous), nous avons ensuite procédé à la synthèse du dérivé de pyrrolidine rigide 6 en utilisant la stratégie montrée au schéma 3. La chloropropylamine N-Boc a été traitée avec de l’hydrure de sodium dans du THF. Le sel a été mis à réagir avec du bromure de 2-bromobenzyle pour donner 17 à 84% de rendement.10 La cyclisation de ce dernier en 2-bromophénylpyrrolidine 19 a été effectuée avec un bon rendement (78%) par l’action du LDA dans le THF. En appliquant la même méthodologie de couplage utilisée pour la préparation du dérivé indane 5, le composé 18 a d’abord été transformé en dérivé 19 du pinacol, qui a ensuite été couplé au dérivé 3-iodoindole sous catalyse au palladium pour donner 20 en rendement modeste (28% pour les deux étapes ). L’élimination du groupe N-Boc de 20 avec TFA suivie d’une cyclisation à médiation par l’éthanolate de sodium et le clivage par N-benzènesulfonamide a donné le dérivé de pyrrolidino-benzazépine 6. Les analogues 5 et 6, ainsi que le dérivé N-méthyle 15 étaient alors évalué pour les activités antiprolifératives dans les cellules KB (Tableau 1) .7 Les deux 5 et 6 étaient considérablement moins actifs que le dérivé non rigide, composé 4, qui possède une CI50 de 35 nM. Ainsi, le dérivé d’indane 5 a inhibé la croissance des cellules KB de 63% à 10 M (correspondant à une CI50 estimée d’un peu moins de 1 M), tandis que l’analogue de pyrrolidine 6 était encore moins cytotoxique, inhibant la cellule KB. Cependant, il est intéressant de noter que la capacité des composés 5 et 6 à inhiber la polymérisation de la tubuline a également diminué (valeurs IC50 de q5.3 et 4.2 μ M, respectivement). ) comparé au composé 4 (IC50 = 1,8 μ M), cette diminution de 2 fois était modeste par rapport à la perte majeure d’activité cytotoxique des deux molécules rigides. Ces résultats apparemment paradoxaux peuvent simplement refléter une moins bonne pénétration cellulaire par les composés 5 et 6 par rapport à l’analogue moins rigide 4, un problème qui n’est pas pris en considération pour l’évaluation de l’activité antimitotique. Gratifiant, on a observé que le dérivé N-méthyle de 4, composé 15, présentait une activité antiproliférative supérieure à celle de 4 lui-même (IC50 de 2 vs 34 nM, respectivement), alors inversement, l’activité antimitotique de 15 (IC50 = 4.1 μ M) était 2 fois moins élevé que celui de 4 (IC50 = 1,8 μ M) mais équivalent à celui du dérivé de pyrrolidine 6 (IC50 = 4,2 μ M). Ceci indique qu’une fonction NH de lactame libre n’est pas essentielle pour l’activité et suggère que la perte de l’activité cytotoxique dans le cas du dérivé de pyrrolidine 6 n’est pas due à l’absence du lactame NH.Table 1Activités Antiprolifératives des Composés 4 – 15 dans des cellules KB Les activités antiprolifératives des composés 5 et 6 ont également été évaluées dans trois autres lignées cellulaires cancéreuses (HCT116, MCF7 et HL60), ainsi que dans des souches résistantes de ces mêmes cellules (HCT15, MCF7R et HL60R). Fait intéressant, comme le montre le tableau 2, bien que les deux composés conservent des activités micromolaires dans toutes les lignées cellulaires, ils sont généralement aussi cytotoxiques dans les cellules résistantes et non résistantes (HCT et HL60) et, dans le cas des cellules MCF7, plus cytotoxiques dans le souches résistantes. Par comparaison, les composés 4 et 15 étaient également actifs dans les lignées cellulaires résistantes et non résistantes à l’exception du HL60 où l’activité cytotoxique était légèrement plus faible dans les cellules résistantes.Tableau 2 Activités antiprolifératives de 5 et 6 comparées à 4 et 15 dans les lignées cellulaires cancéreuses résistantesJoseph et ses collègues ont récemment rapporté les activités antiprolifératives et antimitotiques d’une série d’indolobenzazépinones non substituées (c’est-à-dire des composés de type 4 dépourvus de substituant C5) 11,12. Ces activités étaient généralement moins robustes que dans le cas de nos dérivés C5-alkylés , les auteurs ont été en mesure d’effectuer des études d’amarrage au site de liaison de la colchicine de la tubuline. De manière intéressante, aucune interaction de liaison de l’azote de l’amide d’azote avec la protéine n’a été observée. La présente étude corrobore donc cette conclusion dans la mesure où les modifications structurelles majeures de ce centre, comme le dérivé de pyrrolidine 6, ont très peu d’impact sur l’inhibition de la polymérisation de la tubuline. Nos propres études de modélisation ont montré des caractéristiques notables Plus précisément, nous avons déterminé les préférences conformationnelles de ces trois composés en utilisant la méthode de recherche aléatoire Monte Carlo avec optimisation par la technique de minimalisation de la mécanique moléculaire PRCG en utilisant le programme Macromodel (version 5.5) 13 avec le champ de force MM2. Sur une recherche de 1000 conformères, un seul atrotroisomère aRR a été trouvé pour les analogues 5 et 6 de l’indane et de la pyrrolidine, tandis que des atropoisomères aRR et aSR ont été obtenus pour l’indolobenzazepinone 4.En dépit des différences de rigidité structurelle, tous les atropoisomères aRR adoptent des structures 3D similaires (figure S1 dans les informations de support). Les structures 3D des atropoisomères 5-aSR et 6-aSR manquants ont été construites manuellement. Enfin, les géométries de ces six conformères, ainsi que celles des états de transition correspondants, ont été optimisées en utilisant le programme gaussien 03 au niveau HF / 6-31G + (d, p) (figure ​ ). Les calculs de fréquence vibratoire ultérieurs ont confirmé que ces conformations sont des minima locaux et des maxima, respectivement. Figure 2 Diagrammes d’état de transitions pour l’inversion de configuration atropoisomérique dans les trois systèmes étudiés. Plusieurs conclusions peuvent être tirées de ces études. Tout d’abord, dans les trois cas, l’énergie de l’état de transition du processus d’inversion de l’atropoisomère permet l’établissement, plus ou moins rapidement, d’un équilibre thermodynamique. Les énergies similaires calculées pour les atropoisomères 4-aRR et 4-aSR sont en bon accord avec le mélange de diastéréoisomères observé en solution, 15 qui est probablement la conséquence de l’interconversion de l’atropoisomère à température ambiante. En revanche, un seul diastéréoisomère est observé expérimentalement pour les composés 5 et 6. Dans les deux cas, il peut être formellement prédit qu’il est le plus stable (ARN), et sa présence peut s’expliquer par la sélectivité complète de l’anneau à sept chaînons. réaction de fermeture et / ou par la conversion facile des diastéréoisomères de l’aSR en ceux de l’aRR. Dans l’ensemble, ces études de modélisation prédisent que pour les composés 5 et 6, les seules espèces présentes dans la solution sont les diastéréoisomères aRR (et, bien sûr, leurs énantiomères aSS). Les interactions conformationnelles de la tubuline avec la fonction lactame de ces composés peuvent ne pas être importantes, mais des considérations conformationnelles peuvent affecter la liaison à la tubuline par des interactions stériques défavorables. Des études d’amarrage moléculaire16 ont été réalisées pour identifier les interactions potentielles pendant la liaison à l’indolobenzazépinone. tubuline. Ainsi, comme mentionné ci-dessus, tous les stéréoisomères possibles des composés 5 et 6 (aRR, aSS, aSR, et aRS) ont été utilisés pour l’accostage sur la tubuline, dans l’un des sites de liaison de la DAMA-colchicine (figure 33 et Figure S4 dans l’information de support) .17Figure 3Detail du site de liaison de la tubuline avec (a) conformation aux rayons X de DAMA-colchicine (code PDB: 1SA0); (b) conformations d’amarrage des composés 4-aRR (orange) et 4- aSS (vert); c) la superposition de 6-aSS à la conformation de 4-aSR (vert) montrant … Des études de modélisation moléculaire antérieures avec la série indolobenzazepinone C5-substituée, c’est-à-dire de type 4, ont identifié l’existence de deux sous-poches de liaison distinctes sur la structure tubuline.7,15 Ces sous-poches se chevauchent partiellement (figure ​ (figure3b) 3b) et occupent approximativement le même site de liaison que DAMA-colchicine (figure ​ Le principal critère de sélectivité du ligand entre les deux sous-poches est l’atropoisomérie, les ligands la guration occupe principalement le sous-pommeau gauche, alors que ceux avec la configuration aR sont positionnés principalement dans le sous-pignon droit. Il convient de noter que les substituants alkyle en C5 des composés 4-aRR et 4-aSS occupent la même poche que le cycle C de la colchicine (figure 3a, b), 3a, b), et les interactions hydrophobes favorables. avec cette poche pourrait expliquer la meilleure activité biologique de ces composés par rapport aux dérivés non substitués en C5. Le stockage des composés 5 et 6 dans le site de liaison de la colchicine de la tubuline suit la même tendance, les composés de configuration A occupant principalement le sous-poche gauche. S2 dans les informations de support) et ceux dont la configuration aR est positionnée principalement dans le sous-dossier droit (Figure S3 dans les informations de support). Dans le premier cas, les conformations d’amarrage sont très similaires avec le composé de référence 4-aSR (Figure 3c3c et Figure S2a – d dans les Informations de Support), et leur superposition ne montre pas de collisions stériques avec la protéine. Cela signifie que la liaison des isomères aS des composés 5 et 6 dans le site de liaison de la colchicine de la tubuline est favorisée mais sans le bénéfice d’interactions hydrophobes observées pour les C5-alkyl indolobenzazepinones. Ceci est en bon accord avec les activités biologiques similaires déterminées pour les composés 5 et 6 (IC50 = 4,2 – 5.3 μ M, Tableau 1) et pour l’indolobenzazepinone non substituée en C5 (IC50 = 5.3 μ M) .11,12 Dans le second cas, les conformations d’amarrage sont positionnées différemment par rapport au composé de référence 4-aRS (Figure S3a – d dans l’Information de support), et leur superposition montre que la différence est due à l’importa nt collisions stériques entre les ligands et la surface de la protéine, en particulier pour 6-aRR et 6-aRS (figure ​ (figure 3d3d et figure S3e – h dans les informations de soutien).Ainsi, on peut prédire que la liaison des isomères aR des composés 5 et 6 dans le site colchicine de la tubuline est moins favorable et que l’activité biologique de ces composés est très probablement due à la liaison des isomères aS. En tandem, les résultats des calculs de chimie quantique, qui indiquent que les isomères aRR / aSS représentent la seule espèce présente dans la solution, et les résultats d’amarrage, qui prouvent que la liaison des isomères aS est favorisée, sont des indicateurs forts que 5-aSS et 6-aSS sont les stéréoisomères responsables de l’activité biologique des composés 5 et 6. Une préférence similaire de liaison à l’atropoisomère pour les analogues biphényliques des inhibiteurs de la colchicine a également été rapportée.18 Les résultats présentés devraient être très utiles pour l’avenir, la conception rationnelle de nouveaux inhibiteurs énantiosélectifs de la polymérisation de la tubuline. | ​​n | Synthèse et études SAR des oxadiazines fusionnées en tant que modulateurs de la sécrétion de la maladie d’Alzheimer