Augmentation de l’activité du VIH dans les lésions intra-épithéliales squameuses de haut grade comparées à la muqueuse anale non affectée chez les hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes

Les personnes infectées par le VIH présentant des lésions intraépithéliales squameuses de haut grade ont une activité VIH plus élevée dans la lésion que dans les tissus sains avoisinants. Les résultats indiquent que le nombre de cellules infectées augmente avec l ‘augmentation de l’ activité virale de la muqueuse.

Nous avons étudié des patients avec des lésions intraépithéliales intra-épithéliales de haut grade intra-épithélial HSIL Tous avaient une augmentation du virus de l’immunodéficience humaine de type VIH-ARN et ADN dans les lésions comparées à celles des muqueuses saines. L’ARN VIH et l’ADN épisomique VIH indiquaient une réplication virale en cours , plus encore dans les HSIL anales

type de virus de l’immunodéficience humaine, virus du papillome humain, néoplasie intraépithéliale anale, muqueuse analeVariose antirétrovirale avec antirétroviraux de type VIH efficace, avec charge soutenue d’ARN plasmatique indétectable, ne supprime pas complètement la réplication virale résiduelle Le réensemencement continu de réservoirs cellulaires avec virus, La co-infection avec d’autres agents pathogènes influera vraisemblablement sur la dynamique du réservoir viral ainsi que sur l’excrétion du VIH sur chaque site spécifique. Parmi les hommes séropositifs au VIH qui ont des rapports sexuels avec des hommes MSM, jusqu’à% ont été rapportés avec une infection au VPH du virus du papillome humain anal L’infection au VPH anal est indépendamment associée à l’acquisition du VIH Inversement, le taux de diagnostic du VPH augmente chez un groupe de femmes sud-africaines. première année d’infection par le VIH, indiquant un dysfonctionnement immunitaire muqueux Il a été démontré que les personnes séropositives sont moins enclines à éliminer leur infection au VPH que les personnes non infectées Contrairement à la plupart des autres infections opportunistes, l’introduction du TARV n’a pas réduit les taux de cancer anal diagnostiqué. Une infection prolongée au VPH de la muqueuse anale entraînera une inflammation qui augmentera indubitablement le nombre de cellules immunitaires transportant le VIH ainsi que des cellules non infectées avec une sensibilité accrue à l’infection Ici, nous cherchons à déterminer si le VPH peut influencer le VIH muqueuse

Méthodes

Cette étude a été examinée et approuvée par le Comité d’éthique médicale du Centre médical universitaire, Université d’Amsterdam, Pays-Bas. Après consentement écrit, des HSH séropositifs ont été inclus avec des lésions intraépithéliales squameuses tissulaires de haut grade récemment diagnostiquées HSILs stade néoplasique intraépithélial [ AIN] comme décrit ailleurs Sous haute résolution anoscopique, des biopsies adjacentes ont été prélevées sur une lésion présumée de HSIL et des biopsies adjacentes de muqueuse anale non apparente d’apparence normale. Chaque biopsie a été traitée pour histopathologie afin de confirmer la HSIL et la muqueuse normale. Les autres biopsies des sites respectifs ont été congelées dans de l’azote liquide et cryoconservées à-° C. Au moment de la collecte des échantillons, l’ARN du VIH plasmatique a été mesuré à l’aide du système Abbott m Real-Time. ont été déterminées par tri cellulaire standard activé par fluorescence, en utilisant fluorescent disponible dans le commerce En outre, le sang a été prélevé le jour même de la biopsie à l’aide de BD Vacutainer CPT avec des tubes de citrate de sodium. Les cellules mononucléaires du sang périphérique ont été isolées du sang et cryoconservées – ° C, tout comme le mL de plasma. Stocké à – ° CThawed tissu a été entièrement digéré avec la protéinase K Roche Applied Science à ° C pendant une nuit, par une procédure d’isolement d’acide nucléique utilisant le kit QIAamp Viral RNA Le système de séparation cellulaire MACS a été utilisé pour isoler CD monocytes et lymphocytes CD des PBMC suivi par La détection de l’acide nucléique a été effectuée par un protocole ultrasensible utilisant des amorces hautement conservées et une sonde située dans la région LTR longue répétition terminale RU du génome viral et qui a été soumise à une centrifugation. a été réalisée en utilisant la réaction en chaîne de polymérase de transcription inverse Qiagen OneStep R Kit T-PCR selon les instructions du fabricant Ce test détecte toutes les formes d’ARN viral et d’ADN; Cependant, une étape de préamplification avec choix d’amorces oligonucléotidiques spécifiques permet la différenciation entre formes virales linéaires et circulaires comme décrit Incluant une étape d’incubation DNAse Ambion TURBO DNAse de Life Technologies nous a permis de différencier l’ARN seul ou l’ADN totalement retranscrit. L’ADN du VIH a été amplifié comme décrit précédemment L’entrée d’isolat tissulaire dans la réaction d’amplification a été exprimée en microgrammes de tissu avec des quantités d’entrée de tissu égales utilisées dans toutes les expériences.

RÉSULTATS

L Deux séries d’oligonucléotides ont été utilisées. On est capable d’amplifier uniquement l’ADN viral totalement transcrit, et ainsi, en présence de DNAse, l’ARN reste indétectable; De même l’ADN panneau droit L’autre est capable d’amplifier toutes les formes d’ARN et d’ADN, et la présence de DNAse ne permet que de détecter l’ARN du panel gauche Les chiffres, et indiquent les sujets de l’étude; L’ARN du VIH-LTR a été amplifié comme décrit en B avant la quantification. L’ARN amplifié à partir de la lésion a été fixé à% de barres noires et a été comparé avec le tissu témoin non infecté. à la quantité trouvée dans la zone saine adjacente des barres grises de la muqueuse D, quantification en temps réel TaqMan qPCR de l’ADN du VIH-LTR et / ou de l’ARN de la muqueuse anale du patient L’isolement de l’acide nucléique était le même qu’en B, mêmes ensembles d’amorces utilisés pendant une étape de préamplification d’un cycle Un ensemble d’amorces permettait la quantification de l’ARN seulement après traitement avec DNAse ou les deux ARN et ADN quand DNAse – n’était pas ajouté, tandis que l’autre ensemble quantifiait seulement l’ADN transcrit en l’absence de DNAse – Le tissu sain M est représenté en gris en pourcentage de l’acide nucléique mesuré dans le tissu de lésion correspondant L montré dans les barres noires E, amplification épisomique de l’ADN du VIH par le patient. Le lymphocyte CD a Les fractions de cellules mononucléaires du sang périphérique des monocytes CD ont été analysées avec les zones lésionnelles et saines de la muqueuse anale. Des équivalents ADN de cellules ont été utilisés pour l’amplification des fractions sanguines et de μg de tissu pour l’amplification de la muqueuse anale. , Virus de l’immunodéficience humaine de type HIV-longue répétition terminale LTR amplification dans le plasma des patients, et avec ou sans DNAse I afin de distinguer l’ARN de l’ADN Lorsque DNAse est ajouté, l’ARN est détecté B, amplification VIH-LTR de la muqueuse anale M et néoplasie intra-épithéliale anale lésionnelle biopsies AIN L Deux séries d’oligonucléotides ont été utilisées. On ne peut amplifier que l’ADN viral totalement transcrit, et donc en présence de DNAse, l’ARN reste indétectable; De même l’ADN panneau droit L’autre est capable d’amplifier toutes les formes d’ARN et d’ADN, et la présence de DNAse ne permet que de détecter l’ARN du panel gauche Les chiffres, et indiquent les sujets de l’étude; L’ARN du VIH-LTR a été amplifié comme décrit en B avant la quantification. L’ARN amplifié à partir de la lésion a été fixé à% de barres noires et a été comparé avec le tissu témoin non infecté. à la quantité trouvée dans la zone saine adjacente des barres grises de la muqueuse D, quantification TaqMan en temps réel qPCR de l’ADN du VIH-LTR et / ou de l’ARN de la muqueuse anale du patient L’isolement de l’acide nucléique était le même qu’en B, avec mêmes ensembles d’amorces utilisés pendant une étape de préamplification d’un cycle Un ensemble d’amorces permettait la quantification de l’ARN seulement après traitement avec DNAse ou les deux ARN et ADN quand DNAse – n’était pas ajouté, tandis que l’autre ensemble quantifiait seulement l’ADN transcrit en l’absence de DNAse – Le tissu sain M est représenté en gris en pourcentage de l’acide nucléique mesuré dans le tissu de lésion correspondant L montré dans les barres noires E, amplification épisomique de l’ADN du VIH par le patient. Le lymphocyte CD a On a analysé les fractions de cellules mononucléaires du sang périphérique monocytaire de CD avec les zones lésionnelles et saines de la muqueuse anale. On a utilisé des équivalents d’ADN de cellules pour l’amplification des fractions sanguines et de μg de tissu pour l’amplification de la muqueuse anale. Les échantillons ont été analysés en parallèle de tous les participants à l’étude. Notre choix d’oligonucléotides et selon que l’échantillon a été traité avec DNAse ou non nous a permis de détecter l’ARN et l’ADN viral, ou alternativement l’ARN seul. Les biopsies lésionnelles HSIL de tous les sujets ont montré des quantités plus élevées d’ARN viral que la muqueuse saine voisine. Figure C De plus, le dosage quantitatif TaqMan a identifié des niveaux plus élevés de VIH-ARN et d’ADN dans la HSIL lésionnelle. vs tissu muqueux sain Figure D La présence d’ARN du VIH ne nous permet pas de conclure Si le virus de novo est produit à partir de cellules infectées récemment ou historiquement au repos et qu’il n’indique pas la présence de particules virales infectieuses. Nous y avons répondu en testant l’ADN du VIH épisomique, ce qui est révélateur des cellules infectées récemment. Nous avons trouvé de l’ADN épisomique dans la biopsie HSIL lésionnelle alors que l’échantillon muqueux sain était négatif Figure E, indiquant à la fois la présence d’ADN épisomique dans la biopsie lésionnelle HSIL. augmentation de l’activité virale et présence de cellules récemment infectées dans la lésion

DISCUSSION

Nous avons montré chez les patients des niveaux accrus d’ARN-VIH dans les lésions intra-anales HSIL par rapport aux tissus sains adjacents, indiquant que les lésions néoplasiques HPV sont associées à une activité accrue du VIH comme le montrent les figures C et D. un instantané de l’ARN-VIH après l’amplification finale tandis que la Figure D représente une sortie qPCR plus quantifiable, ce qui explique la différence apparente entre les niveaux d’ARN-VIH chez le patient. – infections dans la lésion Cette découverte appuie une étude précédente décrivant des niveaux plus élevés de VIH-être excrété dans le mucus anal des individus co-infectés par le VIH / HPV vs monoinfectés par le VIH L’activation immunitaire locale pourrait provoquer cette réplication virale accrue, ou, alternativement, les lymphocytes T CD infectés par le VIH peuvent être recrutés dans les foyers lésionnels. Tous les participants à l ‘étude étaient soumis à un TAR suppressif pendant des années; cependant, la présence de VIH-ARN dans la muqueuse HSIL soutient clairement le concept que la réplication continue du virus est en cours dans la muqueuse rectale, et plus encore dans les tissus malades. La présence de VIH-ARN ne permet pas de conclure Le virus provient de cellules infectées récemment ou historiquement et n’indique pas la présence de particules virales infectieuses. Les réservoirs infectés par le VIH réactivés à vie longue pourraient être la source du virus, tout comme les cellules récemment infectées que l’ART n’a pas pu protéger dans le tissu muqueux. Cependant, l’ADN-VIH épisomique présumé avoir une demi-vie courte suggérant une infection récente a été trouvé à la fois dans les lymphocytes CD périphériques et les monocytes CD, suggérant que les particules de VIH de novo peuvent être infectieuses malgré ARTGage et al. que le surnageant des cellules cervicales associées au VPH pourrait induire le VIH-p et réduire la production d’IL-interleukine, ce qui implique que l’infection au VPH peut affecter la pathologie du VIH [Des cytokines pro-inflammatoires peuvent jouer un rôle clé dans le cycle de vie du VIH, en particulier chez les femmes infectées par le VPH. le niveau de transcription génique, favorisant la capacité du VIH à établir des réservoirs latents. Les patients décrits ici ont tous montré une activité accrue du VIH dans la muqueuse HSIL par rapport à la muqueuse anale non-lésionnelle. l’environnement local cytokine / chimiokine tel que MIP-a, IL-, MIP-B, IL-, et RANTES, qui sont tous connus pour affecter l’infection par le VIH et la réplication Il est également possible, cependant, que la lésion représente un site anatomique où les concentrations de médicament sont plus faibles et où la réplication résiduelle du VIH est augmentée Une augmentation des concentrations de VIH- dans la muqueuse HSIL d à un risque accru de transmission du VIH – via les rapports anaux réceptifs

Remarques

Remerciements Les auteurs remercient les participants à l’étude pour leur contribution. GP, OR, JMP, WAP et HJC d V ont conçu l’étude OU identifié des patients et prélevé des échantillons cliniques. GP et JDV ont réalisé des expériences GP a écrit le manuscrit et tous les auteurs ont contribué au projet final. soutien Ce travail a été soutenu par l’Academic Medical Center, University of Amsterdam soutien interne Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: Aucun conflit signaléTous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits potentiels Conflits d’intérêts que les éditeurs considèrent pertinents pour le contenu du manuscrit ont été divulgués